G ének és kromos z ómák

1. Gének és kromoszómák Törőcsik Beáta

2. Összefoglalás • Az eukarióta DNS osztályozása • Miniszatelliták, mikroszatelliták • Transzpozonok, retrotranszpozonok • A DNS kromoszómává történő szerveződése • A nukleoszómák mint szabályozó egységek • A replikáció és a repair kapcsolata

3. Ismétlődő szekvenciák azonosítása; E. coli és borjú DNS renaturációs görbéje E. coli DNS 100% Borjú ismétlődő szekvenciák egyes láncú DNS aránya 50% Borjú egyedi szekvenciák percek napok hetek hónapok renaturációs idő

4. Az eukarióta DNS osztályozása Fehérje kódoló gének egyedi gének (lizozim, inzulin) géncsaládok (-globinok) pseudogének (nem funkcionális duplikátumok) Tandem módon ismétlődő gének rRNS, tRNS, hiszton, Ismétlődő DNS nagy fokban ismétlődő DNS szatellita DNS mérsékelten ismétlődő DNS transzpozonok, retrotranszpozonok nem-virális retrotranszpozonok: nLINES (long interspersed elements) 1-5 kb hosszú, genom kb. 21%-a nSINES (short interspersed elements) 200-300bp hosszú pl. Alu szekvencia: kb. 1millió helyen megtalálható a genomban, a 7SLRNS (SRP) pszeudogénje, genom kb. 13%-a rRNS karácsonyfa

5. Néhány tény a humán genomról 3.2x 109 bp A génekkb 2%-át teszik ki a genomnak 30-40 000 gén (kontra 100 000) 3fehérje/gén Átlagos gén hossz: ~ 8,000bp Átlagos exonhossz: ~200bp Átlagos intronhossz : ~2,000bp n n n n n n Extrémek: VIII faktor gén n n Mutáció: hemophilia A n ~186,000 bp n 26 exon n Exon~9,000 bp, intron ~177,000 bp Dystrophin n n2.4 millió bp (mRNS: 14,000 bp) n A legnagyobb eddig ismert emberi gén n >30 exon n Duchenne-féle muscularis dystrophia

6. Humán Genom Program – részletek • 3.2 milliárd bázispárnyi genom képlete • 99.9%-ban a genom minden emberben ugyanaz • 1.4 millió SNP (single-base DNA variations); közülük 60 000 helyezkedik el kódoló régióban • A felfedezett gének közül legalább 50%-nak nem ismerjük a funkcióját • A genom legalább 50%-a ismétlődő „junk” DNS; rearrangement • Vannak génekben gazdag területek • Gén-betegség-gyógyszer társítás (multifaktoriális kórképekre is; hypertónia, DM) • Strukturális genomikára épülő funkcionális genomika • Evolúció kutatás

7. Miniszatelliták, mikroszatelliták • Miniszatellita: 14-500bp az ismétlődő elem hossza • Mikroszatellita: 2-14bp ismétlődő elem hossza • DNS fingerprint (ujjlenyomat) • Mikroszatellita expanzió (dinamikus mutáció) 1.701 (a genom döntő része) pl. Huntingon kór/Huntingon Chorea ultraibolya elnyelés (260 nm) • AD • megjelenés: 30-45éves korban • progrediáló neurodegeneratív kórkép • gén: 4. kromoszóma rövid karja • a gén triplet (CAG) ismétődéseket tartalmaz • A dopamin receptor génjének transzkripciójához szükséges • 5/100 000 (USA) 1.705 1.687 1.672 szatellitek céziumklorid grádiens centrifugálás

8. DNS fingerprint vizsgálat miniszatellit próbával gyanusított 2 gyanusított 1 MM áldozat vérminták bizonyíték REhely REhely gcg(cccggggtttcccc)gggtttcgcg áldozat 12x/20x gyanusított 1 gcg(cccggggtttcccc)gggtaacgcg 40x/45x gyanusított 2 gcg(cccggggtttcccc)aagtttcgcg 43x/4x

9. Transzpozonok: evolúciós jelentőség génterápia rákkutatás

10. transzpozonok célhely donorhely A. nonreplikatív transzpozíció (“cut and paste”) előtte kihasadás utána B. replikatív transzpozíció (“copy and paste” előtte replikáció utána

11. transzpozázok transzpozonok

12. retrotranszpozonok • virális • nem-virális Retrotranszpozíció (copy and paste) C. donorhely célhely Előtte transzkripció RNS reverz transzkripció DNS Utána • Virális: a retrovírus genom DNS másolatára, provírusára hasonlít, LTR • Reverz transzkriptáz, integráz • Nem virális: celluláris mRNS-hez hasonló (polyA) ilyen az Alu

13. integrázok integráz gátlók (HIV) Retrovírus életciklus

14. Transzpozon és rákkutatás Sleeping beauty transzposon/transzpozáz Többszörös mutációt szenvedett „őskori lelet”, „junk” DNS Hal eredetű DNS; könnyen elkülöníthető a gazda sejt DNS-től Tumorszuppresszorés onkogén kutatásra is Sejtspecifikussá tehető Génterápia

15. A DNS kromoszómává történő szerveződése interfázikus kromatin ELMI mitotikus kromatin fénymikroszkóp/fluoreszcens mikroszkóp

16. Centromer Nagyszámú szatellita DNS: kinetochor fehérjék kapcsolódása • Telomer • Rövid ismétlődő szakaszokból áll (250-1000) (emberben: TTAGGG) • A genom stabilitásának őrzője • Telomeráz hiányában minden egyes sejtciklusban rövidül (testi sejtek nagy része) • Telomeráz aktivitás: tumor sejtekben • Specifikus telomeráz gátlás: • kisérleti stádiumban lévő tumor ellenes szerek Artificial (mesterséges)kromoszóma centomer telomer replikációs origó

17. A telomeráz A késlekedő templátlánc 5’ 3’ 3’ 5’ A vezető templátlánc 5’ 3’ 3’ 5’

18. A telomeráz A késlekedő templátlánc 5’ 3’ 3’ A vezető templátlánc 5’ 3’ 3’ 5’

19. A telomeráz Telomeráz fehérje A késlekedő templátlánc 5’ 3’ 5’ 3’ Telomeráz RNS DNS polimeráz primáz A késlekedő templátlánc 5’ 3’ 3’ 5’

20. Nukleoszóma / Szolenoid 2db H3 2db H4 2db H2A 2db H2B + H1/H5 Szolenoid (30nm)

21. A nukleoszómák mint szabályozó egységek Kovalens modifikációk: acetiláció (lizin) csökken a hiszton affinitása a DNS-hez; transzkripció hiszton aciltranszferáz, hiszton deacetiláz foszforiláció(H1, szerin, treonin) mitózis, kromoszóma kondenzáció ubikvitináció(lizin) a transzkripció szabályozása meiózis/ gametogenezis szabályozása jel a metilációra metiláció (lizin, arginin) gén silencing kromatin kondenzáció transzkripció aktiváció aciltranszferáz asszociáció

22. metafázikus kromoszóma (1400nm) metafázikus kromoszóma magi scaffold (álványzat) fehérjék (kromoszómaváz) (300nm) rozetta hurok szolenoid (30nm) szolenoid gyöngyfüzér nukleoszóma (11nm) kettősláncú DNS (2nm)

23. megfelelő nukleotid;; katalízis. • nem-komplementer bázisok; • prokarióta: DNS polimeráz I, DNS polimeráz III  alegység • eukarióta: DNS polimeráz ,  • az enzim megáll, a 3’ vég az • exonukleáz részre kerül. Hibajavítás után az enzim folytatja a szintézist. megfelelő hidrogén hidak 3’-5’ exonukleáz aktivitás Nem komplementer láncvég: A DNS polimeráz szerepe a replikáció hitelességében 1. A megfelelő nukleotid kiválasztása 10-4 hiba 2. Proofreading (“korrekció”) 10-9 hiba

24. A replikáció és a repair kapcsolata Károsító ágens Következmény Röntgen Ionizáló sugárzás Anti-tumor szerek UV Policiklusos aromás szénhidrogének Röntgen Szabadgyökök Alkiláló ágensek replikációs hiba sejtciklus stop Transzkripció gátlás Replikáció gátlás Kromoszóma szegregáció gátlás A-G mismatch T-G mismatch inzerció, deléció apoptózis Kettős lánc törés AP-hely (apurin, apirimidin) Pirimidin dimérek tumor aging veleszületett betegségek Bázis exciziós repair KO egér intrauterin elpusztul Nukleotid exciziós repair xeroderma pigmentosum Rekombinációs repair Mutációk Kromoszóma rendellenességek Mismatch repair HNPCC Herediter nonpolyposis colon carcinoma tumorképződés

25. Mismatch repair(Hibás bázispárok korrekciója) CH3 CH3 3’ 5’ 5’ 3’ felismerő fehérjék CH3 CH3 3’ 5’ 5’ 3’ endonukleáz CH3 CH3 helikáz 3’ 5’ 5’ 3’ exonukleáz CH3 CH3 5’ 3’ 5’ 3’ DNS polimeráz CH3 CH3 5’ 3’ 5’ 3’ DNS ligáz

26. Herediter nonpolyposis colon carcinoma (HNPCC) A diagnosztizált vastagbél tumorok kb. 3-7 százaléka Lynch szindróma: egyéb (gyomor, vékonybél, máj, endometrium, ovárium) tumor is megjelenik AD (a tumor megnövekedett esélye öröklődik; mutátor fenotípus) Szűrés jelentősége!

27. A replikáció és a repair kapcsolata Károsító ágens Következmény Röntgen Ionizáló sugárzás Anti-tumor szerek UV Policiklusos aromás szénhidrogének Röntgen Szabadgyökök Alkiláló ágensek replikációs hiba sejtciklus stop Transzkripció gátlás Replikáció gátlás Kromoszóma szegregáció gátlás A-G mismatch T-G mismatch inzerció, deléció apoptózis Kettős lánc törés AP-hely (apurin, apirimidin) Pirimidin dimérek tumor aging veleszületett betegségek Bázis exciziós repair KO egér intrauterin elpusztul Nukleotid exciziós repair xeroderma pigmentosum Rekombinációs repair Mutációk Kromoszóma rendellenességek Mismatch repair HNPCC Herediter nonpolyposis colon carcinoma tumorképződés

28. Bázis exciziós repair DNS-glikoziláz (hibás bázist felismeri, hasítja) AP-endonukleáz DNS polimeráz béta DNS ligáz www.nature.com

29. A replikáció és a repair kapcsolata Károsító ágens Következmény Röntgen Ionizáló sugárzás Anti-tumor szerek UV Policiklusos aromás szénhidrogének Röntgen Szabadgyökök Alkiláló ágensek replikációs hiba sejtciklus stop Transzkripció gátlás Replikáció gátlás Kromoszóma szegregáció gátlás A-G mismatch T-G mismatch inzerció, deléció apoptózis Kettős lánc törés AP-hely (apurin, apirimidin) Pirimidin dimérek tumor aging veleszületett betegségek Bázis exciziós repair KO egér intrauterin elpusztul Nukleotid exciziós repair xeroderma pigmentosum Rekombinációs repair Mutációk Kromoszóma rendellenességek Mismatch repair HNPCC Herediter nonpolyposis colon carcinoma tumorképződés

30. UV (Baktérium: dezoxi-pirimidin-fotoliáz) endonukleáz (excinukleáz) helikáz DNS polimeráz béta/I DNS-ligáz

31. A replikáció és a repair kapcsolata Károsító ágens Következmény Röntgen Ionizáló sugárzás Anti-tumor szerek UV Policiklusos aromás szénhidrogének Röntgen Szabadgyökök Alkiláló ágensek replikációs hiba sejtciklus stop Transzkripció gátlás Replikáció gátlás Kromoszóma szegregáció gátlás A-G mismatch T-G mismatch inzerció, deléció apoptózis Kettős lánc törés AP-hely (apurin, apirimidin) Pirimidin dimérek tumor aging veleszületett betegségek Bázis exciziós repair KO egér intrauterin elpusztul Nukleotid exciziós repair xeroderma pigmentosum Rekombinációs repair Mutációk Kromoszóma rendellenességek Mismatch repair HNPCC Herediter nonpolyposis colon carcinoma tumorképződés

32. DNS ligáz