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  1. 色谱分析 应用化学系

  2. 第八章 液相色谱的色谱柱和流动相 • 第一节 高效液相色谱的色谱柱 • 第二节 高效液相色谱的流动相 • 第三节 超高效液相色谱和制备色谱

  3. 重点: 1、掌握液相色谱填料的基质; 2、液相色谱固定相主要类别和制备方法; 3、高效液相色谱流动相的选择。 难点: 1、根据说明书和产品目录正确选择液相色谱柱; 2、流动相紫外截止波长的正确使用。 本章重点难点

  4. 第八章 液相色谱的色谱柱和流动相 • 第一节 高效液相色谱的色谱柱 • 第二节 高效液相色谱的流动相 • 第三节 超高效液相色谱和制备色谱

  5. 第一节 高效液相色谱的色谱柱 一、HPLC柱填料 1、全多孔球形硅胶填料最为普遍 硅胶基质分为微孔(小于2nm),中孔(2-50nm),大孔(大于50nm)硅胶,多用中孔和大孔硅胶填料。 2、其它金属氧化物基质填料 TiO2、ZrO2、高分子聚合物等基质的填料,能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。

  6. 二、硅胶色谱柱填料的优势 • 硅胶有良好的机械强度; • 硅胶的孔结构和比表面积容易控制; • 硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性; • 硅胶表面具有丰富的硅羟基,可以进行化学键合修饰。

  7. 三、硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应 残余硅羟基效应导致碱性分析物严重拖尾,分离度低。 加入碱性流动相 添加剂抑制

  8. 四、反相色谱柱填料保留性能随温度的变化 色谱容量因子k是热力学参数,lnk与1/T在一定温度范围内呈线性关系。可以借助于该计算公式求焓变、熵变。

  9. 五、提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能 • 提纯硅胶,利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料; • 对硅胶进行充分封端(尾); • 利用空间位阻掩蔽残余硅羟基; • 键合相分子中嵌入极性基团(胺基、脲基、酰胺基); • 双齿键合相。

  10. 六、高效液相色谱键合固定相的类型 主要有四类: • 硅-氧-碳键型固定相 • 硅-氮-碳键型固定相 • 硅-氧-硅-碳键型固定相 • 硅-碳键型固定相

  11. (1)硅-氧-碳键型固定相 制备方法之一: 高压、过量醇、280度条件下与硅胶的硅羟基发生反应。 制备方法之二: 亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶,再与过量醇进行醇解反应。 缺点:容易被水解

  12. (2)硅-氮-碳键型固定相 制备方法: 先将硅胶表面氯化,再使伯胺与氯化硅胶反应。 对有机溶剂和pH=3-8的水介质稳定。

  13. (3)硅-氧-硅-碳键型固定相 制备方法: 硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅氧烷进行硅烷化反应。 对有机溶剂和pH=2-8.5的水介质是稳定的。

  14. (4)硅-碳键型固定相 制备方法: 氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应。 稳定性优于硅-氧-碳键型固定相,但生成的产物覆盖度较低。

  15. 七、键合固定相的性质 1、表面覆盖度 完全水解的硅胶表面有8umol/m2硅羟基,由于位阻的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应。 好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来,利用掩蔽试剂与参与硅羟基反应,以消除其不良影响。 表面覆盖度越高,色谱保留越强。

  16. 2、键合相链长的影响 对于反相色谱固定相 键合相链长越长保留越强 对于正相色谱固定相 链长的影响不明显。 3、键合固定相基质性质的影响 基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、覆盖度等,都会对键合相有一定的影响。

  17. 常见商品反相色谱键合固定相 键合相稳定性取决于键合技术

  18. 流动相中有机组分 含量高时 流动相中有机组分 含量低时

  19. 传统的键合和封端(封尾) 封端 三甲基氯硅烷 固定相键合 二甲基硅烷

  20. 流动相pH低于2的环境中 传统的键合相分子容易水解而流失,造成色谱柱损伤,具体表现为保留减弱和残余硅羟基效应。

  21. 侧链位阻基团大的键合相分子 可以提高酸性条件下的稳定性

  22. 无封端

  23. 双封端

  24. 三封端

  25. 双齿 双封端

  26. 如何查阅色谱柱说明书 主要依据色谱柱及填料参数

  27. 色谱柱参数 • 固定相种类、基质类型 • 粒径大小 越小柱效越高 • 孔径大小、表面积 孔径越小表面积越大 • 碳含量高低 越高保留越强 • 封尾类型 残余硅羟基效应 • 色谱柱内径 越小柱效和分离度越高 • 色谱柱长度 越长分离能力越强柱压越高

  28. 第八章 液相色谱的色谱柱和流动相 • 第一节 高效液相色谱的色谱柱 • 第二节 高效液相色谱的流动相 • 第三节 超高效液相色谱和制备色谱

  29. 第二节 高效液相色谱的流动相 一、液相色谱流动相 • 1、常用反相色谱流动相:甲醇-水、乙腈-水 • 2、常用正相色谱流动相:正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇、正己烷-四氢呋喃 • 3、常用离子色谱流动相:稀硝酸、稀氢氧化钠 • 4、需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的吸收强弱,溶剂紫外截止波长见表9-4。

  30. 二、高效液相色谱方法的选择 • 1、反相色谱可以分析多数样品。 • 2、极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留很弱,难以有效分离,可以用正相色谱(氨基柱、二醇基柱)有机溶剂-水流动相分离。 • 3、弱酸、弱碱样品抑制电离,反相分离。 • 4、分析离子,首选离子色谱。 • 5、生物分子的分离模式有反相、离子交换、体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式。

  31. 三、色谱条件的影响 • 1、色谱柱影响分离度,越长分离度越大,内径越小分离度越高。 • 2、柱填料影响分离度,颗粒越小柱效越高,分离度越大,但柱压越高(5μm到3μm柱效提高30%柱压却升高1倍)。 • 3、流动相影响保留,洗脱能力越强,分析时间越短,如:反相色谱流动相中有机组分增加保留减弱。 • 4、流速越高,保留时间越短,但柱压液越高。 • 5、柱温越高,保留时间越短,分离度有所降低。 • 6、在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱峰形时,可以进行梯度洗脱。

  32. 40度 169bar 温度的影响 90度 94bar

  33. SB-C8 4.6X75mm 3.5um 流通池: 5mm, 2.5uL 20~60%B (10min.) 2mL/min. 填料粒径的影响 SB-C8 4.6X150mm 5um 流通池: 10mm, 8uL 20~60%B (30min.) 1mL/min.

  34. 5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm 填料粒径的影响 3.5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm

  35. 填料种类的影响 -CN柱 -苯基柱 C8柱

  36. 第八章 液相色谱的色谱柱和流动相 • 第一节 高效液相色谱的色谱柱 • 第二节 高效液相色谱的流动相 • 第三节 超高效液相色谱和制备色谱

  37. 超高效液相色谱(UPLC) UPLC和快速液相色谱

  38. 超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography\ UPLC)是分离科学中的一个全新类别,UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高效液相色谱是一个新兴的领域,作为世界第一个商品化UPLC产品的Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱系统在1996年问世,之后像安捷伦、岛津等公司也陆续开始生产超高效色谱仪。目前,超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。

  39. 仪器方面代表性的是2004年Waters公司推出Aquity 超高效液相色谱(UPLC),Agilent公司从2006年相继推出Agilent 1200、1260、1290具有更高耐压限和灵活性的高分离度快速液相色谱系统(RRLC)。 • 色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同品牌的亚2μm(1.7μm)的色谱柱,及性能和工作范围各不相同的超高效液相色谱产品。

  40. Agilent 1290 液相色谱系统

  41. 使用亚2微米粒径的色谱柱,用Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱(RRLC)系统进行快速和超快速分析

  42. UPLC的原理与HPLC相同,所改变的地方主要有以下几点:UPLC的原理与HPLC相同,所改变的地方主要有以下几点: • 小颗粒、高性能微粒固定相的出现。 HPLC色谱柱,例如常见的十八烷基硅胶键合柱,它的粒径是5um,而UPLC的色谱柱,会达到3.5um,甚至1.7um,具有更高柱效,更加利于物质分离。 • 超高压输液泵的使用。 由于使用的色谱柱粒径减小,使用时所产生的压力也自然成倍增大。故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。

  43. 高速采样速度的灵敏检测器。 • 与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍,它缩短了分析时间,同时减少了溶剂用量降低了分析成本。 UPLC比HPLC更为优越,主要表现为更高效的分离效率,即分析时间更短和分离度更大。