基 因 工 程

1. 基因工程 四川大学 李永红

2. 基因工程 1 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因工程的操作过程 基因工程的基本概念 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 6 大肠杆菌基因工程 7 酵母基因工程 8 哺乳动物基因工程 9 高等植物基因工程

3. 3 基因工程的基本条件 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞

4. A 用于核酸操作的工具酶 Enzymes

5. 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶

6. 第一节限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

7. 1. 来源 原核生物。 2. 性质 内切酶。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 3. 功能 自我保护作用。 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）

8. （1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。

9. （2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基

10. 二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶

11. 1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。 如EcoB和EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC

12. （2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。 Recognize site cut 1-1.5kb （3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

13. 2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。

14. （2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：

15. （3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ①5’端凸出（如EcoR I切点） 5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- G AATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’

16. ②3’端凸出（如Pst I切点） 5’- CTGCAG -3’ 3’- GACGTC -5’ 5’- CTGCA G -3’ 3’- -5’ G ACGTC

17. （4）粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

19. ② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。

20. （5）同裂酶（Isoschizomers) 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’

21. ② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和Sma I。

22. （6）同尾酶(Isocaudamers） 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ Xho Ⅱ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’ U代表嘌呤；Y代表嘧啶。

23. Sau 3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 ？ GATCT-3’ A-5’ 5’-G 3’-CCTAG BamH I Bgl Ⅱ 5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ Bgl Ⅱ BamH I Sau 3A

24. （7）限制酶的酶活性 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。

25. 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥

26. 使用的时候要特别注意！ EcoR I和BamH I等都有*活性。 EcoR I： GAATTC 在低盐、高pH（>8）时可识别和切割 GAATTA、AAATTC、GAGTTC等 7

27. （8）Ⅱs型限制性内切酶 移动切割（shifted cleavage): 在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。 Hga I 5’ GACGCNNNNN 3’ CTGCGNNNNNNNNNN

28. 3. III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。

29. 核酸限制性内切酶的类型及主要特性

31. 三、限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： • 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。

32. 2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 4.限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。

33. 四、影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 一般采取 ①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④扩大反应体积（>20l）

34. 2. DNA的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

35. 3. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。

36. 4. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 （1）缓冲液的化学组成 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl：维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；

37. 五、限制性内切酶对DNA的消化 1. 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。 GAATTC CTTAAG

38. 2. 完全消化 内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 1 3 2 4 1 2 3 4

39. 3. 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。 1 3 2 4 ? 1 4 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。

40. 4. 限制酶酶切反应的终止 大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。 5. 几种常用限制酶识别位点

42. 6. 限制性内切酶识别序列的交叉列表