Expressão heteróloga das proteínas de fusão GST-Drg11 e His-Drg11

1. Expressão heteróloga das proteínas de fusão GST-Drg11 e His-Drg11 na bactéria E. Coli

2. Introdução Este trabalho laboratorial foi realizado com o intuito de produzir, na bactéria E. Coli, a proteína Drg11 associada a dois “tags” diferentes: • 6 Histidinas • GST (Glutationa S-Transferase)

3. Drg11 • É uma proteína de regulação de 30KDa que funciona como factor de transcrição. • É importante no estabelecimento do circuito nociceptivo durante o desenvolvimento embrionário. • Pode estar envolvido na organização dos neurónios.

4. Importância deste trabalho • A expressão heteróloga de proteínas é muito importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das mesmas. • Em primeiro lugar, torna-se necessária a produção e purificação da proteína e, finalmente, a obtenção do anticorpo que lhe corresponde.

5. As proteínas de fusão consistem na associação de duas proteínas (a Drg11 com um tag). • A utilização de tags possibilita a purificação da proteína de interesse, através da cromatografia de afinidade, por intermédio do uso de resinas com determinados constituintes que apresentam afinidade para esses tags. • His-Drg11: resina com Níquel • GST-Drg11: resina com glutationa

6. Os vectores de expressão utilizados são os plasmídeos: • PGEX – contém o cDNA da proteína de fusão GST-Drg11. • PRSETA – contém o cDNA da proteína de fusão His-Drg11. • Utilizam-se dois vectores diferentes porque as proteínas de fusão podem ter comportamentos diferentes nas culturas de bactérias seleccionadas.

7. E.Coli • A estirpe de E.Coli utilizada foi a BL21. • A BL21 é uma estirpe geneticamente modificada, caracterizada pela inactivação de muitos dos genes que codificam as suas proteases. Assim, a probabilidade de ocorrer a proteólise das proteínas de interesse é menor.

8. Procedimentos Foram-nos fornecidos dois stocks de bactérias desta estirpe previamente submetidas a um processo de transformação com os dois plasmídeos recombinantes: • PRSETA ( His-Drg11) • PGEX (GST-Drg11)

9. PRSETA cDNA da Drg11 His Drg11 1KDa + 30KDa = 31KDa

10. PGEX cDNA da Drg11 GST Drg11 26KDa + 30KDa = 56KDa

11. Protocolo experimental 2 stocks de bactérias submetidas a um processo de transformação Repicou-se e colocou-se em LB/Ampicilina Overnight a 30ºC Rejuvenesceu-se (1/10 em LB/Ampicilina) 2h30 Adicionou-se IPTG Aguardou-se 4h para expressão das proteínas

12. O IPTG é um indutor da transcrição genética que aumenta a quantidade da enzima T7 RNA polimerase, a qual se liga ao promotor T7, iniciando a transcrição do cDNA de interesse. • Para cada conjunto de bactérias transformadas realizou-se um controlo e variou-se a concentração deste indutor, a fim de conhecer a concentração ideal a adicionar.

13. Sedimentou-se por centrifugação Aspirou-se o sobrenadante Colocou-se o pellet em gelo Nonidet P40 Mg2+ PBS DNAse Adicionou-se uma mistura de lise Obteve-se um extracto de proteínas SDS-PAGE Corou-se com Azul de Coomassie

14. SDS-PAGE com amostras do extracto proteico da E. Coli transformada com o plasmídeo PRSETA (cDNA de His-Drg11) Clone 3 Clone 2 IPTG(mM) 2 1 0,5 0 2 1 0,5 0 KDa 200 116 97 66 45 31 21 • Uma banda de peso molecular de cerca de 100 KDa foi induzida. Pode representar a T7 RNA Polimerase. • Na zona de peso molecular esperado (31 KDa) encontrou-se uma banda de 26 KDa .

15. SDS-PAGE com amostras do extracto proteico da E. Coli transformada com o plasmídeo PGEX (cDNA de GST-Drg11) Clone 2 Clone 1 IPTG(mM) 2 1 0,5 0 2 1 0,5 0 KDa 200 116 97 66 45 31 21 • Não se observou nenhuma banda de 56 KDa. • Provavelmente não ocorreu indução.

16. Aparentemente não houve indução da transcrição do cDNA responsável pela produção da GST-Drg11, no entanto parece ter havido expressão da His-Drg11. Para confirmar estas possibilidades: Aplicou-se a técnica imunoblotting: • Repetiu-se o SDS-PAGE; • Fez-se um Western blotting; • Incubou-se com o anticorpo anti-Drg11 disponível.

17. Membrana de nitrocelulose do plasmídeo PRSETA (cDNA de His-Drg11) Clone 2 Clone 3 0 0,5 1 2 0 0,5 1 2 IPTG(mM) KDa 200 – 116 – 97 – 66 – 45 – 31 – 21 –

18. Membrana de nitrocelulose do plasmídeo PGEX (cDNA de GST-Drg11) Clone 1 Clone 2 0 0,5 1 2 0 0,5 1 2 IPTG(mM) KDa 200 – 116 – 97 – 66 – 45 – 31 – 21 –

19. Com bases nos resultados obtidos, conclui-se que não ocorreu a expressão das proteínas His-Drg11 e GST-Drg11.

20. Razões para a falta de expressão da Drg11 • Condições de indução: • Concentrações de IPTG insuficientes; • Temperatura e tempo de indução inadequados. • As proteínas a obter podem ter tido um efeito tóxico nas bactérias utilizadas. • Reconhecimento destas proteínas como sendo estranhas pelas bactérias e, consequente, proteólise das mesmas.

21. Sugestões para trabalhos futuros • Selecção de outra estirpe de E. Coli; • Utilização de um meio de cultura diferente; • Variação das condições de indução; • Fazer nova transformação bacteriana; • Tentativa de expressão destas proteínas por formas truncadas.

22. Bibliografia Alberts B, Jonhson A; Lewis J; Raff M; Roberts K; Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4ª edição, Garland Science, 2000. Cooper, GM. The cell, a molecular approach. 2ª edição, Sinauer Associates, Inc., 2000. www.invitrogen.com www.amershambiosciences.com

23. Agradecimentos • Serviço de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado; • Professor Doutor Carlos Reguenga pela orientação facultada ao longo do trabalho; • Professora Doutora Deolinda Lima pela oportunidade de realizar um trabalho laboratorial.