实验十二过氧化物酶活性的测定

实验十二过氧化物酶活性的测定 ——愈创木酚比色法

一、实验目的 1、掌握过氧化物酶活性测定的原理 2、熟悉酶液提取方法，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性方法。

二、实验原理 • RH2+ H2O2→2H2O + R • 过氧化物酶(POD)可以清除代谢过程中的H202，反应中被氧化的物质可以是多种多样的，因而其生理效应也具有多样性，但清除H202毒害作用是共同的。 • 在H202存在时，过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）氧化成红棕色的4一邻甲氧基苯酚，其红棕色的物质可用分光光度计在436nm处测定其消光值，产物浓度与A436成正比，即可求出该酶的活性。

三、实验步骤 • 1.酶液提取 • ⑴称取样品适量（如果皮1g） • ⑵研磨：剪碎置于研钵中，再加少许水和石英砂，研磨成匀浆。 • ⑶定容：把研钵中的研磨物，移入100ml容量瓶中定容。 • ⑷离心：取一定量离心沉淀（10000r／min冷冻离心20min）。 • ⑸酶液保存：再取其上清液保存在冰箱（或冷处）备用。

2.酶活性测定 ⑴标准曲线制作：取7个10ml刻度试管编号，分别加入5g/ml的英格盐溶液10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0 m1，然后稀释至刻度。其浓度分别为每毫升含5、4、3、2、1、0.5、0g的4一邻甲氧基苯酚。用分光光度计在470nm处测定其消光值。以消光值为纵坐标，以4一邻甲氧基苯酚浓度为横坐标绘制成标准曲线。 ⑵测定：在20ml刻度试管中，分别加入pH5．0醋酸缓冲液1ml，0.1％邻甲氧基苯酚1ml及酶溶液1ml（如酶活性较强，可稀释10倍后再取1ml），摇匀后，置于30℃恒温水浴5分钟达平衡后，立即加入0.08％H2O2溶液1ml并混匀，1分钟后生成红棕色的4一邻甲氧基苯酚的溶液。立即倒人比色杯中，测定其消光度。重复三次，并设对照，用1ml蒸馏水代替0.08％H2O2。从标准曲线上求出相应的4一邻甲氧基苯酚的含量（1g 4一邻甲氧基苯酚相当干1单位的愈创木酚）。

四、实验结果 1．酶活力单位定义：每分钟增加0.01 A436nm值为一个酶活力单位(U)。式中： ΔA436 ——反应时间内OD变化值。 W ——植物鲜重（g）。 t ——反应时间（min）。 D ——稀释倍数（即酶提取液体积÷反应系统内酶液体积） ΔA436×D 酶活力（U）= 0.01×W×t

2．计算不同测定时间的反应速度（v），作出v与t的曲线图并观察反应速度与时间的关系。POD酶活力大小：以最初的反应速度(v）来表示POD酶活力； 记录实验主要步骤，求出过氧化物酶的活性。式中： ΔA436 ——反应时间内OD变化值。 VT ——提取酶液总体积（mL）。 W ——植物鲜重（g）。 t ——反应时间（min）。 ΔA436×VT 过氧化物酶活性= W×t

五、讨论分析 • ⑴过氧化物酶的变化说明了什么？ • ⑵试述过氧化物酶测定原理？ • 六、改进实验建议注意事项 • 1、注意酶液保存时的温度。 • 2、注意测定时的时间掌握。

附：仪器和试剂 • 1.仪器 • （1）高速冷冻离心机；（2）分光光度计；（3）恒温水浴锅；（4）研钵；（5）200μL移液枪；（6）计时器（秒表）；（7）刻度试管等。 • 2.试剂 • （1）样品提取液(用pH7.8的50mmo1/L磷酸钠缓冲液作溶剂，内含2mmo1/L EDTA、聚乙烯吡咯烷酮按总量的1％配制)； • （2）pH6.5缓冲液:50mmol/L 磷酸钠缓冲液；（3）0.06% H202； • （4）0.1%愈创木酚。 • 3. 供试材料:荔枝、龙眼、菠菜、油菜等。

实验十二 过氧化物酶活性的测定