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中医药治疗慢性乙型肝炎免疫机制探索

中医药治疗慢性乙型肝炎免疫机制探索. The exploration to the immunoregulatory mechanism of TCM on CHB. 上海中医药大学附属曙光医院 ShuGuang hospital Affiliated to Shanghai University of TCM 高 月 求 Gao Yueqiu. 汇报提纲. HBV 感染免疫研究进展 ( research progress)

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中医药治疗慢性乙型肝炎免疫机制探索

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Presentation Transcript

  1. 中医药治疗慢性乙型肝炎免疫机制探索 The exploration to the immunoregulatory mechanism of TCM on CHB 上海中医药大学附属曙光医院 ShuGuanghospital Affiliated toShanghai University of TCM 高 月 求 Gao Yueqiu

  2. 汇报提纲 • HBV感染免疫研究进展(research progress) • 不同感染状态免疫应答特点(the characteristic of immune response in different infection states) • 中医药治疗慢性乙型肝炎免疫机制(the immunoregulatory mechanism of CHB with TCM therapy) 中医学：阴阳平衡 免疫学：内外平衡

  3. 1、HBV感染免疫研究进展 research progress on immunoregulatory mechanism of HBV infection

  4. Annu. Rev. Immunol. 2005. 23:307–36

  5. Journal of General Virology (2006), 87, 1439–1449

  6. Acute, Self-Limiting HBV infection • Vigorous, heterogeneous CD4+ TH response to HBe-HBc antigens • Weaker response to viral envelope proteins • Vigorous CTL response to envelope, polymerase, HBcAg and HBeAg • TH1 response is dominant: Lysis of Infected Hepatocytes TH1 CTL + TNFα IL-4 IL-10 APC Inhibition of HBV IFN-γ Inhibitors Virus Neutralization TH2 + B

  7. Chronic HBV Infection • Predominant but weak CD4+ response to HBe-HBc antigens • Relatively weak and narrowly focused weak CTL response; chronic hepatocyte destruction • Maintenance of carrier state caused by an imbalance in the HBeAg/HBcAg specific TH cytokine responses (Milich, 1997) • TH2 response is dominant: TH1 + No Lysis of Infected Hepatocytes CTL IL-4 IL-10 APC Inhibitors TH2 + Antibody B Seroclearance (HBeAg/HBsAg) associated with major immunological changes in TH1/TH2 balance

  8. T Th1 CD8+ CD4+ Th0 Tc Th2 Th? Tc1 Tc2 CD4+ T 细胞与CD8+ T 细胞 response of CTL: clearance of the infection cells response of help T cells cytokine production, participating in CTL response and humoral immunity response of regulatory T cells: regulating theresponse to virus infection

  9. CD8 T cell induced liver disease and viral clearance in HBV infection Recruitment of NK, T, M Disease amplification Matrix Metallo proteinases Fas-L cytokines HBV- Chemokines (e.g. CXCL9,10) CTL HBV- HBV+ Perforin HBV- Non-cytopathic cytokine-mediated HBV control Direct cytolysis Recruitment of PMNs

  10. HBV-specific T cell depletion a）高病毒滴度和病毒抗原（HBsAg/HBeAg)载量 b）树突状细胞功能受损 c）调节性T细胞抑制 d）肝脏微环境引起的耐受 Journal of General Virology (2006), 87,1444

  11. 病毒滴度和病毒抗原载量(high dose of viral load and antigen(HBsAg/HBeAg) • HBV特异性的T细胞，其数目和功能随着HBV DNA的载量而下降 The number and function of HBV-specific T cells decreased while the viral load increased HBV病毒的载量 HBV特异性的T细胞 • HBsAg在血中大量表达，近期的研究发现其能下调树突状细胞CD80，CD86的表达，从而影响DC对T细胞诱导功能。The high expression of HBsAg caused the low expression of CD80,CD86 in DC, which influenced the induce function of DC to T cells Immunology. 2008 Jun 28. [Epub ahead of print] • 病毒水平和HBeAg载量上升会对引起T细胞耐受的抑制性受体PD-1的表达上调The increase of viral load and HBsAg could lead to the up-regulation of PD-1 which can cause the tolerance of T cells 。Hepatology. 2008 Sep;48(3):759-69.

  12. CD4+CD25+ T细胞是维持免疫内稳态重要执行细胞 CD4+CD25+T cells play an important role in maintaining the immune homeostasis. 《现代免疫学》2005年第25卷第1期.75-77.

  13. 树突状细胞功能受损dysfunction of DC • 临床研究显示慢性乙肝病人外周血浆样树突状细胞比正常人的对照在体外诱导更多CD4+CD25+调节性T细胞产生 The clinical research showed that the DC in peripheral blood in CHB patients induced more CD4+CD25+Tregs in vitro than normal control. Hepatol Res.2008 Apr;38(4):362-73.

  14. 肝脏微环境引起的耐受 • immune tolerance in hepatic microenvironment • 淋巴肝：肝脏的NK、NKT及γδT细胞又占机体总淋巴细胞的2/3，枯弗细胞占机体单核-巨噬细胞总数的1/2 以上 • 病毒感染肝细胞分泌IFN功能下降 • 病毒感染后肝脏内肝细胞、胆管上皮细胞、枯弗细胞抗原递呈功能受损诱导T细胞耐受

  15. HBV感染中的体液免疫应答 humoral immune responses in HBV infection disease Nat Rev Immunol. 2005 Mar;5(3):215-29.

  16. e抗原的免疫作用immune function of HBeAg • e抗原抑制T细胞和B细胞对HBcAg作出免疫应答HBeAg suppressed the immune response of T cells and B cells to HBcAg • e抗原持续刺激导致HBV特异性T细胞耗竭continuous stimulus of HBeAg evoked the depletion of HBV-specific T cells • 血清循环HBeAg可作为一种耐受原(HBeAg also can be a toleragen)选择性地削弱致炎性HBc/HBeAg特异性Th1型细胞应答并使其转向Th2型细胞应答，HBeAg特异性Th2细胞占优势可导致HBV慢性携带状态的发生和维持 • 循环HBeAg下调抗病毒清除机制主要通过诱导抗炎症性Th2型细胞因子产生，抑制Th1型细胞因子对病毒的清除，从而导致HBV慢性感染

  17. S抗原和X蛋白(HBsAg and X-protein) • 高剂量s抗原系s抗原特异性CD4和CD8 T细胞的耐受原high dose of HBsAg can be toleragen to HBsAg-specific CD4,CD8 T cells • X蛋白高表达时，可能抑制宿主对乙肝病毒的免疫。一个潜在的机制是抑制蛋白酶活性，可能导致蛋白酶处理抗原肽处理加工受阻high expression of X-protein can suppress the immune to HBV • X蛋白反式激活减少了肝细胞对HLA - I类分子的表达，对HLA Ⅱ类分子的异常表达和对粘附分子ICAM – 1的最大表达lack of co-stimulus signal in immunophenotype of infectious liver cells suppressed the activation of CD4,CD8 T cells • 感染的肝细胞的免疫表型可由于共刺激信号2的缺乏，导致CD4和CD8 T细胞受体的活化受限

  18. 2、不同感染状态免疫应答特点 characteristic of immune response in different infection states

  19. 慢性HBV不同感染状态 正常组 TC1/TC2 CD4+CD25+Treg Th1/Th2 特异T细胞功能 PD-1/PDL-1 NKT细胞表达TNF-α IFN-r Foxp3表达 DC功能 CD4＋细胞、 CD8＋细胞、CD16＋CD56＋ NK内穿孔素、颗粒溶酶B、颗粒溶素、TNF－α、IFN－γ 研究技术路线 免疫耐受组 免疫清除组 临床治愈组

  20. NKT细胞的数量变化the amount change of NKT cells • 与正常组相比,HBV不同感染状态各组NKT细胞的数量均明显降低（P<0.05）the number of NKT cells in different infection state decreased compared to normal control • 免疫耐受组、免疫清除期组、临床治愈组NKT细胞的数量逐渐增加number of NKT cells increased gradually in immune tolerance group, immune clearance group and cured group

  21. NKT细胞分泌IFN-γ和IL-4 的变化 • change of IFN-γand IL-4 produced by NKT cells • 从免疫耐受组到临床治愈组NKT细胞分泌的IFN-γ逐渐增加，而IL-4则相反IFN-γproduction increased gradually in immune tolerance group, immune clearance group and cured group, while IL-4 production decreased

  22. CD4+CD25+Treg • 与正常组相比，Treg/CD4值在HBeAg(+)肝功能正常组最高，p<0.01the value of Treg/CD4 is the highest in HBeAg(+) patients with normal liver function • 三个不同感染状态组均有不同程度的Foxp3基因表达水平的升高，与正常组均有显著性差异，p<0.01 • 以HBeAg(+)肝功能正常组的表达水平最高，HBeAg(-)组最低，两者间有显著性差异，p<0.05，但均与HBeAg(+)肝功能异常组无显著性差异，p=0.078。 注：1 为正常组；2 为HBeAg(+)肝功能正常组；3 为HBeAg(+)肝功能异常组；4 为HBeAg(-)组

  23. CD4+T细胞免疫效应蛋白的表达特征 expression characteristic of immune effector protein in CD4+ T cells • 肝功能正常/异常高病毒复制组TNF-α明显高于正常对照组（P<0.05） • 肝功能异常高病毒复制组组IFN－γ明显低于肝功能正常高/低病毒复制组和正常对照组（P<0.05） • 各组间PF、GrB、GNLY进行比较无统计学意义 李曼, 姚嫣, 高月求. 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T细胞免疫效应分子的 表达特征.细胞与分子免疫学杂志,2009;25(11): 1026-1028 .

  24. CD8+T细胞免疫效应蛋白的表达特征 expression characteristic of immune effector protein in CD8+ T cells • 肝功能正常低病毒复制组的GrB、TNF-α、IFN-γ明显高于肝功能异常高病毒复制组（P<0.05） • 肝功能正常高病毒复制组的IFN-γ高于肝功能异常高病毒复制组（P<0.05） 高月求, 姚嫣, 李曼. 慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞部分免疫效应 分子的表达特征.南方医科大学学报, 2010;30(7):1606-1609.

  25. NK细胞细胞免疫效应蛋白的表达特征 expression characteristic of immune effector protein in NK cells • 同对照组相比，肝功正常高/低病毒复制组和肝功异常低病毒复制组的GNLY明显升高（P<0.05） • 肝功正常/异常的高病毒复制组IFN-γ明显降低（P<0.05） • 肝功正常高/低病毒复制组的PF、GrB、GNLY明显高于肝功异常高病毒复制组（P<0.05） 李曼,姚嫣,高月求.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血自然能杀伤细胞免疫效应 分子的表达.中华肝脏病杂志, 2010; 18 (2):96-100.

  26. A B F C D G E 0.4% 56.2% 34.8% 1.3% 1.9% A1 B1 C1 D1 F1 E1 G1 0.1% 2.4% 5.0% 37.1% 46.6% A-G：健康人，A1-G1：慢性HBV感染者 CD3+CD4+细胞PD-1表达 • 慢性HBV感染者（ALT1-2ULN）外周血 CD3+CD4+细胞PD-1表达明显增多expression of PD-1 in CD3+CD4+ T cell increased in CHB patients with minimally elevated ALT (1-2ULN) • PD-1表达与HBV DNA拷贝数无直接相关，e抗原阴性的患者其PD-1表达增加明显高于e抗原阳性的患者no correlation between the expression of PD-1 and viral load, the expression level of PD-1 in HBeAg(-) patients is higher than HBeAg(+) patients

  27. A C B D E 0.6% 0.2% 0.016% A1 B1 D1 C1 E1 0.1% 0.05% 0.2% A-E：健康人， A1-E1：慢性HBV感染者 树突细胞PD-L1表达 • 慢性HBV感染者（ ALT1-2ULN）外周血树突细胞明显减少，其PD-L1表达明显增多number of DC decreased significantly in CHB patients with minimally elevated ALT (1-2ULN), while the expression of PD-L1 increased • PD-L1表达与HBV DNA拷贝数和e抗原表达无直接相关no correlation between the expression of PD-L1, viral load and HBeAg

  28. 3、中医药治疗慢性乙型肝炎免疫机制研究 immunoregulatory mechanism of TCM therapy on CHB patients

  29. CAO Xuetao. NATURE IMMUNOLOGY 2008

  30. HBV感染的免疫控制 获得性免疫 先天性免疫 B 细胞 树突状细胞 NK 细胞 NKT 细胞 CD4+ T 细胞 CD8+ T 细胞 抗体 anti-HBs anti-HBe anti-HBc 对疾病的早期防御 长期控制和清除 保护

  31. Jianpi Recipe on DC function in CHB patients with spleen deficiency pattern during the immune clearance period 慢性乙型肝炎患者 脾虚患者 非脾虚患者 干扰素治疗组 健脾方+干扰素治疗组 治疗6个月 DC的表面分子 的表达情况 同种异体淋巴细胞增殖能力检测 细胞因子检测

  32. 1、治疗前后DC表型的变化change of phenotype in DC 治疗组HLA-DR、CD86、CD80、CD40、CD11c；对照组HLA-DR、CD40、CD14、 CD11c均较治疗前明显升高，具有显著差异（P<0.01或P<0.05）。两组比较，治疗组的 CD86、CD80、CD40、CD11c升高尤为明显，具有显著差异（P<0.01或P<0.05） 注：本组与治疗前比较，＊＊P<0.01, ＊P<0.05；与对照组比较，△△P<0.01，△P<0.05。

  33. 2、 治疗前后细胞因子和DC刺激活性的变化比较change of cytokine and immune irritancy activity in DC 健脾方联合干扰素治疗前后树突细胞共刺激分子CD86、CD80、CD40、CD11c表达， IFN-γ、IL-12分泌，混合淋巴细胞培养刺激指数明显高于对照组（P<0.01或P<0.05）. 注：本组与治疗前比较，＊＊P<0.01；与对照组比较，△P<0.05。

  34. Bushen Recipe on the function of NKT cell in CHB patients during the immune clearance period 慢性乙型肝炎 补肾方联合拉米夫定 拉米夫定 治疗6个月 Th1 Th2 TC1 TC2 NKT细胞数量 NKT细胞表达TNF-α NKT细胞表达IFN-γ 相关性分析

  35. 2、NKT细胞数量及功能变化change of number and function of NKT cells 与治疗前比较，治疗6个月后，对照组NKT细胞的数量增加不明显，而治疗组能够明显 增加NKT细胞的数量，p﹤0.05；治疗组与对照组均能够促进NKT细胞分泌IFN-γ，抑制 分泌IL-4，但治疗组作用更明显， p﹤0.05。 注：与对照组治疗后比较#p﹤0.05，与治疗前比较*p﹤0.05.

  36. 3.治疗前后T细胞亚群的变化change of T cell subset 与治疗前比较，治疗6个月后，对照组能够明显增加Tc1细胞的数量，提升Tc1/Tc2的比值， p﹤0.05，而对Th1、Th2细胞数量和Th1/Th2比值没有显著影响，P﹥0.05。治疗后，对照 组不但明显增加Th1、Tc1数量、减少Th2、Tc2细胞数量、提升Th1/Th2、Tc1/Tc2比值， 且作用明显优于对照组，p﹤0.05。 注：与对照组治疗后比较#p﹤0.05，与治疗前比较*p﹤0.05

  37. Bushen Recipe on immune effector protein in CHB patients during the immune clearance period 慢性乙型肝炎患者 补肾方联合干扰素 单用干扰素 补肾方联合替比夫定 单用替比夫定 治疗6个月 CD4＋细胞、 CD8＋细胞、CD16＋CD56＋ NK内穿孔素、颗粒溶酶B、颗粒溶素、TNF－α、IFN－γ

  38. 1、 治疗前后CD4+T细胞免疫效应分子表达水平的比较change of the expression of immune molecules in CD4+T cells 干扰素治疗后CD4＋细胞分泌的GrB明显减少（P<0.05），两组的CD4+细胞分泌的TNF－α高于正常对照组，补肾方治疗后IFN－γ明显降低，而且两组都低于正常对照组（P<0.05），补肾方治疗后CD4+细胞分泌的GNLY明显减少。 *P<0.05

  39. 2、 治疗前后CD8+T细胞免疫效应分子表达水平的比较change of the expression of immune molecules in CD8+T cells 补肾方治疗后CD8+细胞分泌GrB、TNF－α、IFN－γ明显降低，且后两者明显低于正常对照组（P<0.05）。干扰素治疗后CD8+细胞分泌的IFN－γ明显降低且低于正常对照组（P<0.05）。 *P<0.05

  40. 3、 治疗前后NK细胞免疫效应分子表达水平的比较（%）change of the expression of immune molecules in CD8+T cells 与治疗前相比，补肾方治疗后NK分泌的PF、GNLY、IFN-γ明显降低（P<0.05），干扰素 治疗后NK分泌的PF、IFN-γ明显降低（P<0.05），而且两者都低于正常对照组（P<0.05）。 *P<0.05

  41. 近年三年发表的相关文章： 1、李曼,姚嫣,高月求.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血自然能杀伤细胞免疫效应 分子的表达.中华肝脏病杂志, 2010; 18 (2):96-100. 2、高月求, 姚嫣, 李曼. 补肾方对慢性乙型肝炎自然杀伤细胞免疫效应分子的影响. 中国中西医结合杂志, 2010;30(7):710-713. 3、汤伯宗, 李曼, 高月求. 抑毒方治疗肝肾阴虚兼湿热型慢性乙型肝炎的疗效及 对T细胞亚群的影响.中国中西医结合杂志, 2010;30(8):823-827. 4、高月求, 姚嫣, 李曼. 慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞部分免疫效应 分子的表达特征.南方医科大学学报, 2010;30(7):1606-1609. 5、高月求. 中医药调控免疫是治疗慢性乙型肝炎优势.中西医结合肝病杂志, 2010;20(3):129-130.

  42. 6、李曼, 姚嫣, 高月求.补肾方对慢性乙型肝炎T淋巴细胞免疫效应分子表达的影响. 中西医结合肝病杂志,2009;19(5):266-268 . 7、李曼, 姚嫣, 高月求. 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T细胞免疫效应分子的 表达特征.细胞与分子免疫学杂志,2009;25(11): 1026-1028 . 8、周振华, 李曼, 高月求. 从肝气虚与肝阳虚论治慢性乙型肝炎探讨. 上海中医 药杂志, 2009;43(12):22-23. 9、郑亚江，高月求 .慢性乙型肝炎脾虚患者树突细胞的表型改变及健脾方的干 预作用. 辽宁中医杂志, 2009;36(3)：323-325. 10、郑亚江, 高月求. 脾虚型慢性乙型肝炎患者树突细胞功能的变化. 上海中医 药杂志.2008, 42(6): 19-23.

  43. 2010年亚太肝病年会 • 1. Yue-Qiu Gao, Xue-Hua Sun, Man Li, et al. Effect of Bushen Recipe on Immune Effector Molecules of Lymphocytes. Hepatology International, 2010; 4(1):136. • 2. Man Li, Xue-Hua Sun, Xiao-Jun Zhu, Yue-Qiu Gao. The Study of the Expression of Some Immune Effector Molecules in CD4+T Lymphocytes from CHB-infected Patients. Hepatology International, 2010; 4(1):330. • 3. Xiao-Jun Zhu, Xue-Hua Sun, Man Li, Yue-Qiu Gao. The Characteristics of the Expession of Immune Effector Molecules in CD8+T Lymphocytes from Patients Infected with Chronic Hepatitis B. Hepatology International, 2010; 4(1):330. • 4. Man Li, Xue-Hua Sun, Xiao-Jun Zhu, Yue-Qiu Gao. The Study of the Expression of Immune Effector Molecules in NK Cells from CHB-infected Patients. Hepatology International, 2010; 4(1):330.

  44. Thank you

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