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酶切、连接与质粒构建

WWW.YRBIO.COM. 酶切、连接与质粒构建. 何彰华 赢润生物技术. 2011 年 7 月 23 日. 2011 年 7 月. 本节讨论内容. 酶切. 连接. 质粒构建. 连接酶 作用模式 连接产物 连接体系 产物的转化. 质粒载体 重组质粒构建策略. 内切酶的简介 内切酶的选择 常用酶切体系 酶切的应用 常见问题. 2011 年 7 月. 第一部分： 限制性内切酶及 酶切. 1.1 限制性内切酶的简介 1.2 限制性内切酶的选择 1.3 常用酶切体系 1.4 酶切的应用 1.5 酶切常见问题及对策.

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酶切、连接与质粒构建

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  1. WWW.YRBIO.COM 酶切、连接与质粒构建 何彰华 赢润生物技术 2011年7月23日

  2. 2011年7月 本节讨论内容 酶切 连接 质粒构建 连接酶 作用模式 连接产物 连接体系 产物的转化 质粒载体 重组质粒构建策略 内切酶的简介 内切酶的选择 常用酶切体系 酶切的应用 常见问题 www.themegallery.com

  3. 2011年7月 第一部分：限制性内切酶及酶切 1.1 限制性内切酶的简介 1.2 限制性内切酶的选择 1.3 常用酶切体系 1.4 酶切的应用 1.5 酶切常见问题及对策 www.themegallery.com

  4. 2011年7月 1.1 限制性内切酶的简介 • 来源：原核生物。 • 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。 www.themegallery.com

  5. 2011年7月 限制性内切酶可分为三类 www.themegallery.com

  6. 2011年7月 限制性核酸内切酶的命名 1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli用Eco表示，所以用斜体字。 EcoRI， EcoRV。 2）用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。 www.themegallery.com

  7. 2011年7月 切割后产生的末端 （1）粘性末端： 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G↓AATTC ……3’ 3’…… CTTAA↑G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成： 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ www.themegallery.com

  8. 2011年7月 （2）平头末端： 例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT↓ATC …… 3’ 3’…… CTA↑TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ www.themegallery.com

  9. 2011年7月 回文序列与非回文序列 • DraIII的识别顺序 5’…… GAATTC ……3’ 3’…… CTTAAG …… 5’ EcoRI 5’…… GATATC …… 3’ 3’…… CTATAG …… 5’ EcoRV 5’…… CAC↓NNNGTG ……3’ 3’…… GTGNNN↑CAC …… 5’ www.themegallery.com

  10. 2011年7月 酶切位点的查询 Vector NTI www.themegallery.com

  11. 2011年7月 酶切位点的查询 www.themegallery.com

  12. 2011年7月 同裂酶 • 来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。 • 同序同切酶 • 同序异切酶 SmaI和XmaI 5’…… CCC↓GGG ……3’ 3’…… GGG↑CCC …… 5’ SmaI 5’…… C↓CCGGG ……3’ 3’…… GGGCC↑C …… 5’ XmaI www.themegallery.com

  13. 2011年7月 同尾酶 • 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切产生相同的黏性末端。 XbaI与SpeI; XhoI与SalI; BamHI与BglII SpeI XbaI 5’…… T↓CTAGA ……3’ 3’…… AGATC↑T ……5’ 5’…… A↓CTAGT……3’ 3’…… TGATC↑A ……5’ 5’……TCTAGT……3’ 3’…… AGATCA ……5’ XbaI∕SpeI www.themegallery.com

  14. 2011年7月 1.2 限制性内切酶的选择 • 根据实验的目的 结合载体和基因的特性选择合适的酶切位点； • 根据酶本身的属性 酶的酶切效率； 双酶切共用缓冲液； 选择何种公司的产品：Fermentas、TaKaRa、NEB。 www.themegallery.com

  15. 1.3 常用酶切体系-单酶切 2011年7月 必要的时候添加BSA；温度 37 ℃；反应时间 1-2 h。 www.themegallery.com

  16. 1.3 常用酶切体系-双酶切 必要的时候添加BSA；温度 37 ℃；反应时间 1-2 h。 www.themegallery.com

  17. 双酶切buffer www.themegallery.com

  18. 2011年7月 1.4 酶切的应用 • 构建质粒 • 鉴定 • 图谱 www.themegallery.com

  19. 2011年7月 无切割 正常切割 1.5 酶切常见问题及对策 1）DNA完全没有被内切酶切割 A. 内切酶失活； B. DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶 抑制因子； C. 条件不适（试剂、温度）。 D. ?? www.themegallery.com

  20. 2011年7月 Dam、Dcm和CpG甲基化 ① 如果DNA底物是从表达 Dam 或 Dcm 甲基化酶 的菌株中分离而得； ②且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠。 例如，从 dam+E.coli中分离的质粒 DNA 完全不能被识别序列为 GATC的 MboI 所切割。 www.themegallery.com

  21. 2011年7月 2）DNA切割不完全 A. 内切酶活性下降； B. 内切酶稀释不正确； C.DNA不纯，反应条件不佳； D. 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存 在其它修饰； E. 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性。 www.themegallery.com

  22. 2011年7月 3）DNA片段数目多于理论值 A. 其它内切酶污染； B. 底物中含其它DNA杂质； C. 内切酶星号活性。 www.themegallery.com

  23. 2011年7月 星号活性 在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。 内切酶的用量过大； 甘油浓度大于12%； 盐离子浓度过低或过高； Mn2+ 的存在。 www.themegallery.com

  24. 2011年7月 第二部分：DNA的连接反应 2.1 连接酶 2.2 连接酶作用模式图 2.3 连接产物的形态 2.4 常用连接体系 2.5 连接产物的转化 www.themegallery.com

  25. 2011年7月 2.1 连接酶 原理：催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5′磷酸基团与3′羟基形成磷酸酯键。 功能：将两条双链DNA片段连接起来，实现 DNA的体外重组。 注意：DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。 www.themegallery.com

  26. 2011年7月 5′ 3′ 5′ 3′ — A A T T C********* —OH *********G P G********* OH— *********C T T A A — P 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ **********GAATTC********** **********CTTAAG********** 5′ 3′ 2.2 连接酶作用模式图 （1） 连接粘性末端 连接酶 www.themegallery.com

  27. 2011年7月 5′ 3′ 5′ 3′ —OH — ************TC ************AG CT************* P — GA************* OH— P 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ *************AGCT************** *************TCGA************** 3′ 5′ 2.2 连接酶作用模式图 （2） 连接平末端 连接酶 www.themegallery.com

  28. 2011年7月 连接酶 AA BB 重组质粒 2.3 连接产物的形态 酶A 酶B 载体 酶A 酶B 基因 www.themegallery.com

  29. 2011年7月 连接酶 2.3 连接产物的形态 酶A 酶B 载体 酶A 酶B 基因 无意义的连接，干扰正常连接。 www.themegallery.com

  30. 2011年7月 2.4 常用连接体系 连接体系中载体与插入片段的摩尔比控制在1/3至1/10之间，体系在循环水浴中16℃连接。 www.themegallery.com

  31. 2011年7月 2.5 连接产物的转化 连接好的DNA产物可直接转化感受态细胞，用抗性平板筛选阳性克隆。 www.themegallery.com

  32. 2011年7月 第三部分：质粒构建 目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入表达载体才能实现。 作为基因工程表达载体所需具备的基本条件： A. 含复制起始，能自我复制； B. 带有抗性基因，便于筛选和鉴定； C. 有多克隆位点，便于重组操作； D. 带有强启动子。 www.themegallery.com

  33. 2011年7月 pET-28a：原核细胞表达质粒 多克隆位点 T7 启动子 复制起始 抗性标记 www.themegallery.com

  34. www.themegallery.com

  35. 2011年7月 pcDNA3.1：真核细胞表达质粒 www.themegallery.com

  36. 2011年7月 3.1 重组质粒构建--粘性末端连接 www.themegallery.com

  37. 2011年7月 3.2 重组质粒构建--平末端连接 www.themegallery.com

  38. 2011年7月 3.3 重组质粒构建--分步连接 www.themegallery.com

  39. 2011年7月 3.4 重组质粒构建--连接、酶切、再连接 www.themegallery.com

  40. 2011年7月 3.5 重组质粒构建--接头连接 www.themegallery.com

  41. 2011年7月 3.6 重组质粒构建--同尾酶连接 www.themegallery.com

  42. 构建多基因串联重组质粒 www.themegallery.com

  43. 2011年7月 3.7 重组质粒构建--不依赖于酶切连接 Red同源重组 www.themegallery.com

  44. 2011年7月 腺病毒重组 3.7 重组质粒构建--不依赖于酶切连接 www.themegallery.com

  45. 2011年7月 谢谢大家！ 祝：身体健康， 学习愉快！ www.themegallery.com

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