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嗜酸乳杆菌代谢产物乳酸对体外培养 MIMVECsLPS 模型信号通路调控作用的研究

乳酸对 LPS 诱导的 RIMMVECs 细胞信号通路 NF-κB 的调控作用. 嗜酸乳杆菌代谢产物乳酸对体外培养 MIMVECsLPS 模型信号通路调控作用的研究. 北京农学院 任晓明 13910224882@163.com. 研究背景和目的. 乳酸菌 乳酸菌是目前应用最广且效果最好的一类益生菌，但其保健抗病的作用机制还不十分明了。 乳酸菌代谢产物乳酸的抗病作用

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嗜酸乳杆菌代谢产物乳酸对体外培养 MIMVECsLPS 模型信号通路调控作用的研究

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  1. 乳酸对LPS诱导的RIMMVECs细胞信号通路NF-κB的调控作用乳酸对LPS诱导的RIMMVECs细胞信号通路NF-κB的调控作用 嗜酸乳杆菌代谢产物乳酸对体外培养MIMVECsLPS模型信号通路调控作用的研究 北京农学院 任晓明 13910224882@163.com

  2. 研究背景和目的 • 乳酸菌 乳酸菌是目前应用最广且效果最好的一类益生菌，但其保健抗病的作用机制还不十分明了。 • 乳酸菌代谢产物乳酸的抗病作用 我实验室前期研究表明，乳酸对大肠杆菌和沙门氏杆菌的腹泻模型具有很好的抗病作用，对大肠杆菌内毒素（LPS）所致的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMMVECs）损伤有明显的修复和抗损伤作用 。

  3. 研究背景和目的 微血管内皮细胞（MVECs）在炎症反应中的作用 很多研究已经证明，在未受到损伤因子攻击情况下，MVECs分泌少量的白细胞介素（IL-1和IL-6）。当受到内毒素（LPS）、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子攻击的时候IL-1、IL-6的表达量大幅上调，参与炎症反应和炎性损伤过程。

  4. 研究背景和目的 • LPS对MVECs的损伤作用 致病性大肠杆菌（EPEC）能引起仔猪腹泻等多种疾病，主要是通过其产生的毒素（LPS）发挥致病作用。近年来国内外对LPS的研究较多，很多集中在LPS所介导的细胞信号转导通路的调控上。 LPS能激活靶细胞信号转导通路表达炎性因子，导致一系列炎性反应，是EPEC致病性的的重要机制。

  5. 研究背景和目的 • LPS对MVECs细胞信号转导通路NK-κB的激活及其作用 LPS攻击MVECs后，激活NK-κB信号通路产生IL-6、TNF-α、NO和表达黏附因子，这些变化在局部组织损伤和修复、弥散性血管内凝血（DIC）、脓毒血症和多器官功能衰竭的发生过程中发挥重要作用。

  6. 研究背景和目的 LPS诱导MVECs产生IL-6和TNF-α。如果能抑制这些因子的合成，便可下调NF-κB细胞信号转导通路的激活程度，进而抑制炎性反应。为深入探讨益生菌代谢产物抑制LPS激活NF-κB细胞信号转导通路的调控作用，本实验测定了不同条件下NF-κB p65亚基的mRNA和蛋白的表达情况。从基因和蛋白表达两个层面，探讨乳酸菌代谢产物调控靶细胞抗损伤的细胞信号转导通路的某些机制。

  7. 材料与方法 细胞分组 试验 • 空白对照组 ELISA • LPS（阳性）对照组 • 乳酸高浓度预处理组 RealTime-PCR • 乳酸中浓度预处理组 WesternBlot • 乳酸低浓度预处理组

  8. RIMMVECs的分离、培养与鉴定 RIMMVECs分离自10日龄内乳鼠肠粘膜，至细胞生长到80%呈融合状态时进行传代培养，对传至第6代的细胞进行鉴定。方法是采取SP免疫细胞化学法进行内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原（F-ⅧRag）的鉴定。

  9. 荧光定量PCR • 将RNA反转录为cDNA，按照以下反应体系进行：模板（RNA）3μg；引物（50μM）T18,4.0μl；DEPC处理水至25μl，混匀，70℃5min，立即冰浴；5×buffer，8.0μl；dNTP（10mM）,4.0μl;RNase Inhibitor,1.0μl,混匀，37℃5min；M-MuLV，2.0μl，42℃60min，70℃10min。 • 定量PCR检测按照以下反应体系进行：模板（cDNA）/ddH2O,1.0μl;10μM引物F/R，0.5μl;2×PCR Mix，12.5μl；Eva green；1μl；ddH2O,10μl，混匀，置于荧光定量PCR仪中。

  10. 制备RNA • RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。

  11. M 1 2 3 4 M 荧光定量PCR • 通过PCR验证筛选出各基因的引物PCR如下图 M：DL2000 DNA ladder 1：β-actin 2：NF-kB 3：β-actin空白对照 4：NF-kB空白对照

  12. 引物名称及序列

  13. 检测基因表达水平 用RT-PCR方法检测IκB的基因表达水平。设计引物，提取细胞总RNA加入反应体系中，进行逆转录以及PCR扩增cDNA。然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射灯下观察，最后对凝胶条带进行灰度扫描，将灰度值进行统计学处理。

  14. ----1.56×10 (7) ----1.56×10 (6) ----1.56×10 (5) ----1.56×10 (4) ----1.56×10 (3) ----1.56×10 (2) ----1.56×10 (1) ----空白对照 内参基因引物检出限 • 内参actin基因的引物检出限

  15. 检测蛋白表达水平 用Western blot方法检测IκB的蛋白表达水平。LPS攻击细胞，用裂解缓冲液裂解细胞，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。加入兔IκB多克隆抗体，加入HRP标记的羊抗兔IgG，DAB显色，用凝胶分析软件对显色条带进行半定量分析，面积与荧光强度的乘积代表IκB蛋白表达的相对量。

  16. ----1.22×10 (7) ----1.22×10 (6) ----1.22×10 (5) ----1.22×10 (4) ----1.22×10 (3) ----1.22×10 (2) ----1.22×10 (1) ----空白对照 NF-kB基因引物检出限 • NF-kB基因的引物检出限

  17. 内参actin基因的标准曲线

  18. NF-kB基因的标准曲线

  19. 数据处理 • 实时荧光定量PCR：目的基因的相对表达量用ΔΔCt法计算，ΔCt（目的基因）=Ct（目的基因）－Ct（内参基因），ΔΔCt=ΔCt（处理组）－ΔCt（空白组）。目的基因的相对表达量=2-ΔΔCt ，数据用spass11.5进行统计分析，荧光实时定量PCR结果使用均值±标准误表示，其中各基因的表达量所示结果均经过内参β-actin表达量进行校正。

  20. 数据处理 • Western Blotting:检查PVDF膜上的预染Marker在膜上的对应位置及电泳起始点，确定目标条带后用Gel-ProAnalyzer6.0软件测定目标条带面积和灰度值，将NF-κB p65和β-actin对比做半定量分析。 蛋白含量=条带面积×平均灰度；蛋白半定量值= NF-κB p65蛋白含量/β-actin蛋白含量。数据采用均值±标准误表示，统计分析应用SPSS11.5统计软件，多组间比较采用单因素方差分析。显著性差异水平为P＜0.05，极显著性差异水平为P＜0.01。

  21. 结 果 IL-6 Your Text Your Text Your Text TNF-α Your Text Your Text Your Text 细胞鉴定 ELISA RT-PCR WesternBlot

  22. RIMMVECs的培养

  23. RIMMVECs的鉴定

  24. ELISA检测结果

  25. ELISA检测结果

  26. RT-PCR扩增曲线 • NF-κB p65亚基基因的扩增曲线

  27. RT-PCR扩增曲线 • 内参β-actin的扩增曲线

  28. RT-PCR熔解曲线 • NF-κBp65亚基的熔解曲线

  29. RT-PCR熔解曲线 • β-actin的熔解曲线

  30. RT-PCR试验结果 • NF-κB基因在不同处理组中的实时荧光定量PCR结果

  31. Western Blotting结果 • NF-κB p65的蛋白Western Blotting • β-actin • NF-κB p65

  32. Western Blotting结果

  33. Western Blotting结果

  34. 结 论 乳酸对LPS激活RIMMVEC的NF-κB细胞信号转导通路具有明显的抑制作用，下调了转录因子NF-κB的转录活性，进而抑制了炎性因子TNF-α和IL-6的表达。

  35. 请各位批评指正！ 谢谢！

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