大肠杆菌表达重组人粒细胞 - 集落刺激因子包涵体的复性与纯化

1. 化学国家级实验教学示范中心 NORTHWEST UNIVERSITY 创新实验I-化学生物学 实验四 大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化 <化学生物学实验>课程组 王骊丽

2. 实验技能训练要点 主要新知识 • 基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。 • 重组蛋白分离纯化：细胞收集 、破碎；包涵体的溶解； • 蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法； • 蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法

3. 实验技能训练要点 主要知识回顾 • 仪器分析：色谱技术 –液相色谱技术…… • 仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振…… • 化学生物学导论：蛋白质、酶…… • 蛋白质与酶化学：重组DNA技术…… • 蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征….. • 有机化学：荧光探针

4. 背景知识 关键词：重组人粒细胞-集落刺激因子、液相色谱复性与纯化 Recombinant human granulocyte colony stimulating factor, Renaturation and purification by liquid chromatography • 实验室研发从E.coli 中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品，包括以下步骤： • ①目的基因DNA片段的获得；②E.coli 重组表达载体的构建；③在E.coli 中对目的基因进行表达；④目的蛋白从E.coli 裂解液中的纯化；⑤规模化生产工艺（包括工程菌发酵、复性与纯化工艺的放大等）的建立。

5. 粒细胞白血病(ML) 在我国其发病率占成人新诊断白血病20%以上，年发病率为10万分之1。 实例：粒细胞白血病

6. 人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用 SCF;IL-2 NK IFN- SCF Pro-T T CLP SCF B HSC Pro-B 单核细胞 SCF SCF GMP CMP 粒细胞 SCF SCF MEP 巨核细胞 基质细胞 SCF EPO 红细胞

7. rhG-CSF的理化性能与生物学功能

8. 几种PFLC法复性与纯化rhG-CSF包涵体结果比较

9. 一、实验目的 二、实验原理 三、实验仪器与试剂 四、实验步骤与方法 五、实验结果与讨论 六、实验延伸 思考题 参考文献 实验内容提要

10. 一、实验目的 通过人粒细胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因扩增和在大肠杆菌DH5α中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特点;了解二硫键形成与构象的关系； • 掌握包涵体的变性、复性的基本原理； • 熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法； • 熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。

11. 二、实验原理--基因工程技术 • 基因工程技术是指人们按照自己的愿望，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物物种，使现有物种出现人类需要的性状的技术; • 以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术，使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。

12. 包含体 胞浆 可溶部分 离心 超声破碎 沉淀 外周质 洗涤 溶解 离心 包涵体复性 二、实验原理—包涵体的形成和特点 • 大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在； • 包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性； • 包涵体能够溶解于强的变性剂，如8 mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。

13. 二、实验原理—体外复性的主要途径 • 直接稀释法（Direct dilution），包括透析法和超滤法 • 液相色谱复性法（Chromatographic methods for protein refolding） • 人工配基辅助的蛋白复性（Artificial molecular chaperone assisted protein refolding)

14. 液相色谱复性蛋白的过程 蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。

15. 三、实验试剂和仪器 试剂 尿素（成都金山化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；三氟醋酸（分析纯，Fluka公司）；硫酸铵、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠、浓盐酸等均为分析纯（西安化学试剂厂）。α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）均购自Sigma公司（St. Louse，MO，美国）。

16. 三、实验试剂和仪器 仪器 离心机 纯水仪 二氧化碳培养箱 日立F-4500荧光光谱仪 快速蛋白纯化仪

17. 四、实验步骤与方法—实验天数 环节1 环节2 环节3

18. PCR扩增技术获得 rhGC-CSF基因 蛋白的生物活性和 理化性质分析 获得有活性的蛋白 回收扩增片断 插入克隆载体进行测序 多种方法复性重组 包涵体蛋白 正确的基因 获得包涵体蛋白 插入表达载体表达 5L或50L发酵罐 筛选表达最好的菌株 四、实验步骤与方法

19. 四、实验步骤与方法-流动相组成 • 普通SEC：0.15 mol/L NaCl ，3.0 mol/L urea ，0.05 mol/L Tris-HCl ，1mmol/L EDTA + 1.0 mmol/L，pH8.0 GSH/0.1mmol/L GSSG ，15%甘油; • 脲梯度SEC：A为 0.05 mol/L Tris (pH 8.0) ，1.0 m mol/L EDTA ， 0.15 mol/L NaCl ，2.5 mmol/L GSH + 0.8 mmol/L；B为 8.0 mol/L urea。

20. 1、普通SEC法对hG-CSF复性与纯化 • 流动相平衡Superdex 75(16/20)柱子，然后将200 μL 8.0 mol/L脲溶解变性的rhG-CSF溶液直接进样到平衡好的色谱柱中，用平衡时所用的流动相洗脱复性的rhG-CSF。 • 流速1.0 ~ 4.0 mL/min，检测波长为280 nm。 • 收集复性的rhG-CSF馏分，测定蛋白浓度。 • 将收集液用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/L NaAc缓冲液(pH 4.0)透析，透析后的含rhG-CSF的溶液用于测定生物活性。

21. 2、脲梯度SEC复性rhG-CSF • 用流动相A和B按一定比例的混合液平衡色谱柱，然后在10或者15 mL内将B液浓度增至100%。按上述方法平衡后，将不同体积还原变性的rhG-CSF直接进入SEC色谱柱，然后以2.0 mL/min的流速用B液洗脱。检测波长280 nm。 • 收集复性的rhG-CSF，用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/L 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）透析。透析后的含rhG-CSF的溶液用来测定蛋白浓度和生物活性。

22. 优化的条件下复性与纯化 • 普通SEC法：流动相为 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris, 1.0 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG , 3.0 mol/L urea ,15% 甘油 (v/v) ，pH 8.0 ； • 脲梯度SEC法：流动相为 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris,1.0 mmol/LEDTA ,2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG ,15% 甘油 (体积比)，pH 8.0；流动相B：流动相A+ 8.0 mol/L 脲 • 流速为2.0 mL/min, 检测波长280nm

23. rhG-CSF的SEC复性与同时纯化产物色谱图； • 复性与纯化产物SDS-PAGE分析图； • 紫外分光光度法测定复性与纯化产物含量结果； • 荧光光谱表征复性前后的构象； 五、实验结果与讨论

24. 五、实验结果与讨论-色谱图 脲梯度SEC复性rhG-CSF的色谱图 SEC复性rhG-CSF的色谱图 实线代表rhG-CSF的洗脱曲线，* 表示复性的 rhG-CSF

25. 1 2 3 五、实验结果与讨论-电泳分析 1, rhG-CSF 包涵体提取液; 2, 分子量标准蛋白(从底部到顶部依次为14,400; 20,100; 31,000; 43,000; 66,200; 97,400 Dalton); 3, SEC复性并部分纯化后的rhG-CSF

26. 五、实验结果与讨论-对比分析 脲梯度SEC和普通SEC对rhG-CSF复性的比较

27. 五、实验结果与讨论-蛋白的构象表征 荧光光谱法 • 圆二色谱法

28. 五、实验结果与讨论-注意事项 • 使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。 • 样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。 • 电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。 • 在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太快造成蛋白质聚集析出。

29. 六、实验延伸-二硫键对接 Zhang L, Chou CP, Moo-Young M. Disulfide bond formation and its impact on the biological activity and stability of recombinant therapeutic proteins produced by Escherichia coli expression system. Biotechnol Adv 2011; 29:923–9

30. 六、实验延伸-蛋白质折叠机制 最具有代表性的是多维能量景观学说（multidimensional energy landscape)和折叠漏斗(folding funnel)模型。这两种机制都可以很好地预测蛋白的复性路径。 蛋白折叠的漏斗形能量景观图

31. 六、实验延伸-蛋白折叠研究新技术 实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应

32. 思考题 • 蛋白质的CD光谱与其分子构象有何关系？圆二色性光谱法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？ • 蛋白质的紫外光谱与其分子构象有何关系？该方法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？ • 你能否通过关键词，查阅和设计一个有功能细胞因子从基因克隆、表达与复性的实验？

33. 参考文献 • Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation with simultaneous purification of rhG-CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr., 2007,21: 1291-1296 • Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor produced from Escherichia coli using size exclusion chromatography, J Liquid Chromatogr. & Related Tech., 2006, 29:203-217 • Wang CZ, Wang LL, Geng XD. High recovery refolding of rhG-CSF from escherichia coli using urea gradient size exclusion chromatography. Biotechnol.Progr., 2008, 24(1): 209-213 • Clark ED.Protein refolding for industrial processes. Curr Opin Biotechnol. 2001; 12(2):202-207. • Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng, 2005, 99(4): 303-310. • Geng XD, Wang CZ. Protein folding liquid chromatography and its recent developments. J Chromatogr B, 2007, 849: 69-80. • Geng XD, Wang LL. Liquid chromatography of recombinant proteins and protein drugs. J Chromatogr B, 2008, 866: 133-153.

34. 请预习下一个实验 实验五 罗丹明基“OFF-ON”型荧光探针对金属离子的识别特性及其生物学应用（选修） 《化学生物学》实验课程组 李剑利