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Citometria de Fluxo - PowerPoint PPT Presentation


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Citometria de Fluxo. Citometria: Análise quantitativa de parâmetros celulares (células, núcleos, cromossomas, mitocôndrias, etc) Citometria de Fluxo: Análise multiparamétrica de partículas (uma a uma) em suspensão. Princípio:.

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Presentation Transcript
slide1

Citometria de Fluxo

  • Citometria: Análise quantitativa de parâmetros celulares (células, núcleos, cromossomas, mitocôndrias, etc)
  • Citometria de Fluxo: Análise multiparamétrica de partículas (uma a uma) em suspensão.
princ pio
Princípio:
  • Fazer passar as partículas em suspensão, de uma forma alinhada, por um feixe de luz
  • A interacção das partículas com o feixe gera sinais que são captados por detectores apropriados
  • A informação produzida pode ser gerada:
  • Pela dispersão do feixe de luz
  • Pela luz emitida por fluorocromos após excitação pelo feixe de luz
requisitos b sicos num cit metro de fluxo
Requisitos Básicos num Citómetro de Fluxo
  • Suspensão de partículas
  • Fluxo laminar
  • Fonte de iluminação
  • Câmara de Fluxo
  • Filtração da dispersão de luz e fluorescência
  • Captação da dispersão de luz e fluorescência
  • Conversão dos sinais em valores analógico-digitais
  • Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento no computador

Fluídos

Óptica

Electrónica

flu dos
Fluídos
  • Injecção da amostra no líquido de envolvimento (sheath fluid), passando por um pequeno orifício central do fluxo (50-300 µm)
  • As partículas fluem no centro, não se misturando com o restante líquido de envolvimento
  • A injecção da amostra em fluxo laminar e a regulação da pressão são conseguidas através:

- Pressão Diferencial

- Velocidade de Fluxo

- Fluxo Contínuo

c mara de fluxo
Câmara de Fluxo

Agulha de

injecção

Laser

Líquido de

envolvimento

Dispersão laser

Ponto de Hidrofocagem

ptica
Óptica
  • Fontes de iluminação:
    • Lâmpadas de Mercúrio
    • Lasers
  • Emite num comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), monocromático.
  • Produz um feixe de luz coerente
fotosensor de dispers o frontal fs

Laser

Sensor de FS

Fotosensor de Dispersão Frontal (FS)
  • Capta a intensidade da dispersão frontal
  • A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao tamanho e forma das partículas

.

fotosensor de dispers o lateral ss

Laser

Sensor

de FS

Sensor SS 900

Fotosensor de Dispersão Lateral (SS)
  • Capta a intensidade e luz dispersa a 90o
  • A intensidade dessa dispersão é proporcional ao tamanho, granularidade e forma das partículas
dispers o da fluoresc ncia

Laser

Sensor de FS

Detectores de Fluorescência

(PMT1, PMT4 etc.)

Dispersão da Fluorescência
  • A fluorescência emitida é detectada por fotosensores que recebem o comprimento de onda seleccionado
  • A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de filtros e de espelhos.
tipos de fluorocromos

Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)

Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm)

FITC 488 525

Cy3 488 565

R-PE (PE) 488 575

Pe-Cy5 (TC1) 488 667

PerCP (BD2) 488 675

PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695

Texas Red 595 615

APC 633, 635 660

Cy5 633, 635 667

Tipos de fluorocromos
slide13

488

350

457

514

610

632

300 nm

400 nm

500 nm

600 nm

700 nm

Texas Red

PI

Ethidium

PE

FITC

Espectros de Excitação / Emissão

slide14

Características dos fluorocromos:

1)Emissão adequada (> 600 nm) de forma a minimizar problemas de autofluorescência

2) Emissâo de intensidade significativamente maior que a de autofluorescência

3) Espectro não sobreposto com outros fluorocromos

4) Facilmente conjugável com anticorpos

  • Fuorescências derivadas de Energias de Transferência
  • Sobreposição de emissão de luz dos fluocromos
  • Tranferência dessa luz entre o 1º e o 2º fluorocromo
  • O segundo emite num comprimento de onda superior ao primeiro
slide15

Filtro ou Espelho Dicrónico Colocado a 45o

Fonte de Luz

Luz Transmitida

Luz Reflectida

slide16

Captação dos Parâmetros de Análise:

PMT

4

PMT

Filtros

Dicróicos

3

Câmara de

Fluxo

PMT

2

Filtros

Bandpass

Fotosensores

PMT

1

Laser

slide17

Electrónica

  • Processamento electrónico do sinal gerado nos sensores que é traduzido num histograma ou scatter plot
slide18

Complexidade

Antigénios celulares

Tamanho

Metabolismos

Enzimas

Receptores

ADN

Citoquinas

O que pode então dizer um Citómetro de fluxo de uma célula?

Tamanho (FSC)

Complexidade (SSC)

Fluorescência relativa.(FL1, FL2, FL3,

slide19

Aplicações

  • Imunologia
  • Hematologia
  • Anatomia patológica
  • Biologia celular
  • Oncologia
slide20

G0

/G1

G2

/M

S

0

200

600

800

1000

4N

2N

DNA content

Aplicações diversas

  • Detecção de apoptose
  • Permeabilidade membranar
  • Mudanças do conteúdo
  • de DNA
  • Estudos enzimáticos
  • funcionais
  • Resistência a fármacos
slide21

Imunologia - Aplicações práticas

  • Separação de células sanguíneas
  • Diferenciação de sub populações de linfócitos T
  • Diferenciação linfócitos B
  • Diferenciação de células NK
  • Quantificação antigénica
  • Variações linfoproliferativas (idade,
  • , imunodeficiências, neoplasias, transplantes,
  • doenças autoimunes, inflamações)
  • Fagocitose
slide22

Granulócitos

Monocitos

Linfocitos

  • Separação de células sanguíneas
slide23

Diferenciação da subpopulação de linfócitos

Os linfócitos T, originados no Timo experimentam maturação que resulta de um processo de selecção positiva e negativa, durante o qual se formam as células CD4 e CD8. Os linfócitos B originados na medula óssea vão expressando sequencialmente antigénios específicos CD19+, CD10+ e CD20+, até se diferenciarem terminalmente

em Igs.

As células NK carecem de marcadores

das células T ou B, mas são constitutivamente

citotoxicas. Na sua diferenciação

associam-se a marcadores de funções

linfocitárias: CD16

slide25

FACS

  • Fluorescence-activated cell sorter
  • Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas diferentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8)
  • Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente.
  • O citómetro de fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser
slide26

Sensor Fs

488 nm laser

Detectores de Fluorescências

-

Placas Carregadas

+

Tubos para Recolha do Produto Separado

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FACS: desenhado para a análise computarizada de células e separaçaõ das mesmas

  • No exemplo, uma população celular mista é marcada com 2 anticorpos específicos de antigénios de superfície : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-A são marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a população é introduzida na camara de FACS. As células vão ser expelidas pelo “nozzle” gerando microgotas, cada contendo uma única célula. Cada microgota assim que expelida recebe uma pequena carga eléctrica-excitação do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a intensidade da fluorescência emitida e detectada no computador. Esta carga eléctrica dirigida por 2 placas de deflecção faz que cada microgota possa ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar as populações com perfis diferentes- População A e População B. No computador cada “dot” representa uma célula, e as células que “caem” à esquerda inferior do quadrante do scatter são consideradas background- não reagiram c/ anti-A ou anti-B.
slide28

Aplicações clínicas: são múltiplas principalmente na detecção de antigénios “target” nas células sanguíneas

  • Classificação de leucemias
  • Detecção de HIV
  • Marcadores tumorais
  • Na previsão da evolução do curso de doença
  • Detecção microbiológica : bactérias, fungos,parasitas e vírus
  • Detecção e quantificação de ac.nucleicos virais e antigénios virais
  • Teste de susceptibilidade a drogas