实验九（ Ⅱ ） 微生物的显微镜直接计数法

1. 实验九（ Ⅱ ）微生物的显微镜直接计数法

2. 一、实验目的及要求 • 了解血球计数板的构造、明确其计数原理。 • 掌握使用血球计数板显微镜下直接进行微生物计数的方法。

3. 二、实验原理 • 显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 • 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

4. 二、实验原理 • 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。 • 计数室的刻度有两种：一种是计数室（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。 • 计数室由400个小方格组成。

5. 血细胞计数板构造示意图

6. 二、实验原理 • 每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。 • 使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。 • 因此，以25个中方格的计数板为例，设5个中方格的总菌数为A，菌液的稀释倍数为B，则： • 1ml菌悬液中的总菌数= (A÷5)×25×104×B

7. 三、实验器材 1．菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 2．仪器、材料：显微镜、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、无菌滴管、擦镜纸。

8. 四、实验步骤 • 1．无菌生理盐水适当稀释制备酿酒酵母菌悬液。 • 2．镜检血球计数板。 • 3．血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从盖玻片的边缘滴入一滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。 • 4．静置5min，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数室，再转换高倍镜观察并计数。 • 5．计数时若计数室由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小格）的菌数。如为25个中方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。 • 6．如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。 • 7．清洗血球计数板。

9. 五、实验报告 1.结果 A表示五个中方格的总菌数；B表示菌液稀释倍数。 2.思考题 血球计数板计数误差来自哪些方面，应如何避免。