1 / 78

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA III.

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA III. GÉLKROMATOGRÁFIA IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest. GÉLKROMATOGRÁFIA GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY SEC

lada
Download Presentation

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA III.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKA III. GÉLKROMATOGRÁFIA IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

  2. GÉLKROMATOGRÁFIA GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY SEC GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC

  3. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath (1961-63) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC) Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA

  4. A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

  5. PORÓZUS GÉLSZERKEZET ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

  6. GÉLKROMATOGRÁFIA • AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) • Kémiai tulajdonságai: • Szerkezet – stabilitás • Funkcionális csoportok • Biológiai aktivitás • Molekula méret-tömeg, eloszlás • Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek • Fizikai tulajdonságai: • Oldékonyság (poláris-apoláris) • Szolvatáció – hidratáció • Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció • Hidrodinamikai jellemzők • Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó, • belső viszkozitás, flexibilitás

  7. GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ) ADALÉKOK detergensek, stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,

  8. GÉLKROMATOGRÁFIA • AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS • A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE • Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás, • SZERVETLEN OXIDOK • SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék (CPG), • SZERVES POLIMEREK • Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metak-rilát, poliéter- észter, polivinilalkohol, polisztirol-divinilbenzol, • KEVERT TÍPUSOK • Szervetlen-szerves, Szerves-szerves, Si02-poliszacharid Dextrán-agaróz, egyéb polimerek, akrilamid - PS-DVB

  9. AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

  10. TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

  11. N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

  12. GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK (GPC-SEC, PITTCON 1993-94)

  13. GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK (GPC-SEC, PITTCON 1993-94)

  14. A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: • durva (coarse) 100-300, közepes (medium) 50-150, • finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.

  15. HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5 m) EM KÉPE

  16. HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE

  17. HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI

  18. A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

  19. AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %) Agaróz 0.3 – 1.5 Sephadex 3 - 30 Poliakrilamid 2.5 - 15 A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) ! ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek. A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.

  20. Az elválasztás technika szemlélete szerint a GÉLKROMATOGRÁFIA aFOLYADÉK-FOLYADÉKMEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA SPECIÁLIS HATÁRESETE ahol azállóés azáramlófázisugyanaz az oldószer, a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák. Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA a fázisok közötti térfogati megoszlás (fázisarány, megoszlási együttható) a molekula méretének (tömegének) függvénye. Kav ~ f(log M) (A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)

  21. Ve Vo BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL log M  Ve / V0 = Kav (Vt – V0) (Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – 1 log M  Kav Determann egyenletek (1966-69) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre logM = M0 - (6.06-5.00 )  = a xerogél szemcse sűrűsége

  22. MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  23. A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval

  24. A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a– Stokes-féle rádiusz, D–diffuziós állandó, υ– molekula fajlagos parciális térfogata, η– viszkozitási együttható.

  25. A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA BEKONCENTRÁLÁS SÓMENTESÍTÉS PUFFER CSERE CSOPORT FRAKCIONÁLÁS TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA KROMATOFOKUSZÁLÁS

  26. MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  27. CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  28. POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  29. TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  30. HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

  31. A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE

  32. HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA ELFO VLDL LDL HDL UC

  33. HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN

  34. LDL HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK SEC ELVÁLASZTÁSA AGARÓZ (Sepharose 6B) GÉLOSZLOPON VLDL HDL

  35. SZOLUBILIZÁLÁS ÉS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA

  36. DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSÁRA ÉS TISZTÍTÁSÁRA

  37. IONCSERÉLŐ FOLYADÉK KROMATOGRÁFIA (IEX) Ion Exchange Chromatography

  38. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Ószövetség (Exodus xv. 23-5) víz tisztítás Arisztotelész (cit. Hellferich, 1959) tengervíz sótlanítás Bacon (XVII. sz. eleje) alkimia, gyógyszerészet, derítés-perkolálás Thompson (1850), Way (1852) kationok adszorpciója agyagon Eichorn (1858), Boedecker (1859) egyensúlyi folyamatokra empirikus egyenletek Harms (1896) cukorgyártásban szabadalom Harms és Rümpler (1903) szervetlen szintetikus ioncserélők Gans (1905) Al-szilikátok alkalmazása vízlágyításra Fischer és Hoffmeister (1910-20) Kuhn, Lederer és Winterstein (1932-35) fehérje kémiai alkalmazások, tisztítás elválasztás Adams és Holmes (1935- ) polimerkémia, szerves ioncserélők, PDB műgyanták, bakelit (hanglemez !) Moore és Stein (1945) aminosav analizis - készülék

  39. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA • AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) • ÖSSZETEVŐK IONOS, vagy IONIZÁLHATÓ TULAJDONSÁGA • FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK TÖLTÉSE ÉS MINŐSÉGE • IZOELEKTROMOS PONT (makromolekula, biopolimer) • A TÖLTÉS VISZONYOK (net charge) VÁLTOZÁSA • A pH ÉS IONERŐSSÉG HATÁSÁRA • MOLEKULA TÖMEG ÉS SZERKEZET • DETEKTÁLHATÓSÁG • BIOLÓGIAI AKTIVITÁS • OLDÉKONYSÁG • STABILITÁS

  40. FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI

  41. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁLLÓ FÁZIS – IONCSERÉLŐ TÖLTETEK GYENGE - ERŐS ~~N+H2<~~N+HR <~~N+R2 <~~N+R3 erősen szubsztituens (R) függő

  42. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA IONCSERÉLŐ TÖLTETEK KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, CM, PO4) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !

  43. IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK

  44. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS A LEGFONTOSABB MODULÁLÓ TÉNYEZŐK KÉMHATÁS - pH - PUFFEREK AZ IONCSERE EGYENSÚLYI FÁZISÁBAN A MEGFELELŐ ELLENION ÉS AZ IONCSERÉLŐ TÖLTÉSÉNEK BIZTOSÍTÁSA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) TÖLTÉSÉNEK KIALAKÍTÁSA (pozitív, vagy negatív, pl. fehérjék) AZ IONCSERE pH-val MODULÁLT ELÚCIÓS FÁZISÁBAN AZ ELVÁLASZTANDÓ VEGYÜLETEK ÉS AZ IONCSERÉLŐ IONOS KÖLCSÖNHATÁSAINAK SZELEKTÍV MEGVÁLTOZTATÁSA

  45. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS • IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol:

  46. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS • POLARITÁS AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁSÁNAK VÁLTOZTATÁSA (CSÖKKENTÉSE) ADALÉK OLDÓSZEREKKEL METANOL, ACETONITRIL AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK ERŐSSÉGÉNEK VÁLTOZTATÁSA

  47. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA MUNKAFOLYAMATAI

More Related