土壤微生物的分离纯化与鉴定

1. 土壤微生物的分离纯化与鉴定 庞昕 山东大学微生物技术国家重点实验室

2. 内容简介 • 微生物实验复习总结 • 自主设计性实验 • 作业递交方式 • 文献检索简介 • 科技论文写作

3. 第一部分 微生物实验复习总结

4. 微生物实验内容 基本知识学习 基本技能训练 第1周 实验一： 预备实验 第2周 实验二： 实验室环境和人体表面微生物的检查（一） 实验室环境和人体表面微生物的检查（二） 第3周 实验三： 细菌的分离纯化 第4周 实验四： 普通光学显微镜的使用及细菌革兰氏染色法 第5周 实验五： 细菌的鞭毛染色及活细菌运动性的观察 第6周 实验六： 细菌的芽孢染色法 酵母菌的准备 第7周 实验七： 酵母菌形态特征观察及死活细胞的鉴定 酵母菌子囊孢子的观察 放线菌的准备 第8周 实验八： 放线菌形态的观察 霉菌的准备 第10周 实验九： 霉菌形态的观察 第11周 实验十： 微生物大小、数量的测定 第12周 实验十一：微生物生理生化反应（一） 第13周 微生物生理生化反应（二） 第14周 实验十二：微生物的分离、纯化与鉴定（一） 第15周 微生物的分离、纯化与鉴定（二） 第16周 微生物的分离、纯化与鉴定（三） 以验证性 实验为主 自主设计性实验

5. 基本知识学习与基本技能训练 • 培养基制备 • 高压灭菌 • 无菌操作技术 • 细菌接种与培养 • 划线分离与纯培养技术 • 通过菌落特征对细菌进行简单分类

6. 基本知识学习与基本技能训练——培养基制备 • 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。 • 在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子等。不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。 • 由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。此外，做好的培养基要做无菌检验。

7. 基本知识学习与基本技能训练——培养基制备 根据微生物的种类和实验目的不同，培养基的类别如下： 按成分的不同：天然培养基 、合成培养基和半合成培养基 。 按培养基的物理状态分：固体培养基、半固体培养基和液体培养基。 按培养基的用途分：基础培养基 、营养培养基（加富培养基）、鉴别培养基和选择培养基 。

8. 基本知识学习与基本技能训练——培养基制备 目前已有各种商品化的“干燥培养基”成品出售。这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法、真空干燥法、低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理、充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解、分装，高压蒸气灭菌，即可使用。这种培养基的优点是配制省时，携带方便，使用简易，质量稳定。

9. 基本知识学习与基本技能训练——灭菌 • 紫外杀菌——穿透力差，适合表面杀菌 • 过滤——小量或不宜高压的物品 • 高压灭菌——根据灭菌物品选择高压温度和时间 针头式除菌滤器 圆筒式正压过滤器 手提式自动高压灭菌锅 三洋全自动高压灭菌锅

10. 基本知识学习与基本技能训练——无菌操作 • 创造无菌环境（酒精灯、超净工作台、生物安全柜、生物安全实验室） • 保护实验材料不受外界微生物污染 • 保护环境不被实验材料污染

11. 生物安全实验室建筑技术图

12. 基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

13. 基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养

14. 基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞

15. 基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养基本知识学习与基本技能训练——细菌接种与培养 常用的接种方法： 划线接种 点接种 穿刺接种 涂布接种 液体接种 注射接种

16. 基本知识学习与基本技能训练——划线分离与纯培养技术基本知识学习与基本技能训练——划线分离与纯培养技术

17. 基本知识学习与基本技能训练——划线分离与纯培养技术基本知识学习与基本技能训练——划线分离与纯培养技术

18. 基本知识学习与基本技能训练——划线分离与纯培养技术基本知识学习与基本技能训练——划线分离与纯培养技术 平板划线分离的方法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法

19. 基本知识学习与基本技能训练——菌落形态特征认识及分类基本知识学习与基本技能训练——菌落形态特征认识及分类

20. 基本知识学习与基本技能训练——菌种保藏（P266）基本知识学习与基本技能训练——菌种保藏（P266） • 定期移植法：又称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 • 液体石蜡保藏法：亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。 • 沙土管保藏法：是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液，注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室温进行保存的一种菌种保藏方法。 • 冷冻干燥：将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。包括：真空冷冻干燥法、-80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。

21. 微生物实验内容 基本知识学习 基本技能训练 第1周 实验一： 预备实验 第2周 实验二： 实验室环境和人体表面微生物的检查（一） 实验室环境和人体表面微生物的检查（二） 第3周 实验三： 细菌的分离纯化 第4周 实验四： 普通光学显微镜的使用及细菌革兰氏染色法 第5周 实验五： 细菌的鞭毛染色及活细菌运动性的观察 第6周 实验六： 细菌的芽孢染色法 酵母菌的准备 第7周 实验七： 酵母菌形态特征观察及死活细胞的鉴定 酵母菌子囊孢子的观察 放线菌的准备 第8周 实验八： 放线菌形态的观察 霉菌的准备 第10周 实验九： 霉菌形态的观察 第11周 实验十： 微生物大小、数量的测定 第12周 实验十一：微生物生理生化反应（一） 第13周 微生物生理生化反应（二） 第14周 实验十二：微生物的分离、纯化与鉴定（一） 第15周 微生物的分离、纯化与鉴定（二） 第16周 微生物的分离、纯化与鉴定（三） 以验证性 实验为主 自主设计性实验

22. 验证性实验 • 该部分主要是加强学生对微生物形态、大小、数量及生理生化特性的认识。

23. 生理生化实验 糖发酵实验 硫化氢实验

24. BIOLOG微生物鉴定系统

25. 微生物实验内容 基本知识学习 基本技能训练 第1周 实验一： 预备实验 第2周 实验二： 实验室环境和人体表面微生物的检查（一） 实验室环境和人体表面微生物的检查（二） 第3周 实验三： 细菌的分离纯化 第4周 实验四： 普通光学显微镜的使用及细菌革兰氏染色法 第5周 实验五： 细菌的鞭毛染色及活细菌运动性的观察 第6周 实验六： 细菌的芽孢染色法 酵母菌的准备 第7周 实验七： 酵母菌形态特征观察及死活细胞的鉴定 酵母菌子囊孢子的观察 放线菌的准备 第8周 实验八： 放线菌形态的观察 霉菌的准备 第10周 实验九： 霉菌形态的观察 第11周 实验十： 微生物大小、数量的测定 第12周 实验十一：微生物生理生化反应（一） 第13周 微生物生理生化反应（二） 第14周 实验十二：微生物的分离、纯化与鉴定（一） 第15周 微生物的分离、纯化与鉴定（二） 第16周 微生物的分离、纯化与鉴定（三） 以验证性 实验为主 自主设计性实验

26. 第二部分 自主设计性实验

27. 自主设计性实验——土壤微生物的分离纯化与鉴定自主设计性实验——土壤微生物的分离纯化与鉴定 • 让学生以小组为单位对感兴趣的课题进行文献调研、实验设计、实验操作，筛选出自己感兴趣的菌株并进行鉴定（包括分离株的菌落特征、菌种的形态、大小、染色特性、生理生化特性等，再结合伯杰氏手册进行鉴定），最后以科技论文的形式提交实验报告。在实验过程中，开放实验室，学生可以充分利用课余时间，根据需要安排时间。 • 该研究型教学是学生对前两部分内容的复习巩固与灵活运用，在这个过程中老师进行适当指导。目的是通过该实验开拓学生的思路，激发学生的探索精神，培养学生查阅文献、分析问题、解决问题的能力、综合归纳的能力以及科技论文写作能力；同时，提高同学之间的协作能力，使学生的综合素质得以提高。

28. 微生物冶金 • 微生物冶金是目前十分前沿的科学技术，特点是利用微生物将矿石中有价元素选择性浸出，直接制备高纯金属及其材料。我国虽然是有色金属矿产资源储量大国，但是我国有色金属矿产资源的显著特点是低品位、复杂、难处理，现有的常规选冶方法生产成本高，环境污染严重。而微生物冶金技术成本低、污染少，而且冶金过程反应温和、环境友好，不产生传统选冶过程的废气、废渣、废水污染，可以显著改善生态环境。

29. 微生物冶金 • 以中南大学副校长邱冠周教授为首席科学家的国家973计划“微生物冶金的基础研究”，揭示了浸矿微生物的分离、纯化、种群生态规律，获得到多种活性高、耐受毒性能力强、用于不同用途的高效菌株；应用基因芯片技术等基因组学方法进行了功能基因组学研究，首次对铁和硫氧化相关基因进行系统全面的研究，实现从传统的单基因功能研究向新的多基因功能同步研究的跨越。对解决微生物冶金速度问题有重要突破，在国内首次将生物浸出—萃取—电积工艺按工业规模用于从低品位铜矿石生产金属铜获得成功。直接从浸出液制备高纯金属，应用于原生黄铜矿占到90%以上、铜品位仅为0.09%的废石和我国西部硫化-氧化复合矿，生产99.999%高纯铜的成本仅为常规生产流程成本的1/2，并低于国外相同工厂生产水平。

30. 微生物冶金 • 微生物冶金技术将提高矿产资源的利用率两倍以上。以铜为例，传统的采选冶技术资源开发率只有28％左右，而利用微生物冶金技术开发率接近100％，就可使我国实际可利用铜金属量从1431万吨增加至4150万吨以上，铜保有储量的服务年限从13年延长至50年！目前，我国在微生物冶金应用方面刚刚起步，由于国内有90％为复杂低品位原生硫化矿，因此这一技术的应用前景十分广阔。生物冶炼技术对解决我国特有的低品位、复杂矿产资源加工难题，扩大我国可开发利用的矿产资源量，提高现代化建设矿产资源保障程度和保护环境，促进走可持续发展新型工业之路，实施西部大开发战略等都具有重要的作用。生物冶炼将为我国冶金行业开创新局面。

31. 微生物降解污染物

32. 微生物降解污染物

33. 生物质利用 • 目前，世界各国都在致力于开发高效、无污染的生物质能源利用技术，预计到2020年，全球总能耗将有40％以上来自生物质能源。我国已颁发《可再生能源法》，生物质能源是其中最重要的可再生能源之一。所获取的能源之表现形式有热能、电能以及各种生物燃料如生物柴油、生物乙醇、沼气、生物氢等。 • 纤维素降解菌相关研究。

34. 产糖微生物

35. 极端微生物 • 乳酸菌 • 病原微生物 • 海洋微生物 • 粘细菌 • ……

36. 土壤是微生物生活的大本营

37. 备选题目 • 固氮菌的分离纯化与鉴定 • 解磷菌的分离纯化与鉴定 • 产淀粉酶菌株的分离纯化与鉴定 • 抗抗生素菌株的分离纯化与鉴定 • 产脂肪酶菌株的分离纯化与鉴定 • 嗜酸性细菌的分离纯化与鉴定 • 耐碱菌株的分离纯化与鉴定

38. 实验目的要求 通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法、无菌操作和菌种保藏技术。 掌握微生物的鉴定技术 掌握文献检索与科技论文写作方法

39. 技术路线 • 实验准备： 选题——实验设计——土样采集（根据实验目的选择合适地方进行采样） • 微生物的分离与纯化： 培养基制备（根据实验目的制备相应的培养基）——土样稀释（根据情况选择稀释度）——接种（根据实验目的选择合适的接种方法） ——培养（根据实验目的选择合适的培养条件）——菌种的分离纯化——菌种保存 • 微生物鉴定： 菌落形态、菌体形态、染色特性、生理生化特性、伯杰氏手册 • 论文撰写与提交：

40. 培养基的配制与灭菌——实验器材 • 药品及试剂：根据所要制备的培养基准备所需试剂。 • 仪器及其它：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、枪尖、枪盒、玻璃珠、pH试纸等

41. 培养基的配制与灭菌——培养基制备与分装 • 称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。 • 熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。 • 调pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH至培养基所需pH。 • 过滤：趁热用多层纱布过滤（根据实际情况确定是否过滤） • 分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。 • 加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。

42. 培养基的配制与灭菌——无菌水的制备 • 用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。 • 用10ml吸管取9ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。

43. 培养基的配制与灭菌——器皿的准备 • 培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸或牛皮纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。 • 吸管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。 • 玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。 • 枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。

44. 培养基的配制与灭菌——高压灭菌 • 将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般121℃，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，112 ℃，30min灭菌）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 • 灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。培养基冷至50℃左右，倒平板。 • 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。

45. 土样 培养基 无菌的培养皿、三角瓶、水、玻璃珠、玻璃刮刀、吸管、枪尖等 微生物的分离与纯化——实验器材

46. 微生物的分离与纯化——操作步骤 • 制备土壤稀释液 • 涂布平板 • 培养 • 挑菌落 • 平板划线分离 • 菌种保藏（留作鉴定）

47. 微生物的分离与纯化——土样稀释及平板涂布（P31）微生物的分离与纯化——土样稀释及平板涂布（P31）

48. 微生物的分离与纯化 • 挑单菌落 • 划线分离 • 菌种保存

49. 分离菌株的鉴定 ——实验目的 • 掌握常用的微生物鉴定方法。 • 掌握生理生化试验的原理与方法。 • 复习以前学过的各种染色方法 • 学习使用伯杰氏手册

50. 分离菌株的鉴定——实验原理 微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。 各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。　　细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础，例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。