1 / 27

LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES D’EXPLORATION

LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES D’EXPLORATION. S. Fichelson, 17 Juin 2004 – 5èmes journées du GFM - Rouen. SOMMAIRE. Définition des cellules souches Transdifférenciation : polémiques Ontogénèse Méthodes d’exploration Régulation

kyle
Download Presentation

LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES D’EXPLORATION

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES D’EXPLORATION S. Fichelson, 17 Juin 2004 – 5èmes journées du GFM - Rouen

  2. SOMMAIRE • Définition des cellules souches • Transdifférenciation : polémiques • Ontogénèse • Méthodes d’exploration • Régulation • Expansion

  3. Les Cellules Souches TOTIPOTENTES PLURIPOTENTES Endoderme Mésoderme Ectoderme MULTIPOTENTES PROGÉNITEURS ¢ MATURES Tissu Hématopoïétique Foie Intestin Muscle Peau Cerveau

  4. « TRANSDIFFÉRENCIATION » DES CELLULES SOUCHES Nombreuses études in vivo et in vitro chez la souris Mise en évidence du phénomène de transdifférenciation (1999-2003): Transdifférenciation = phénomène rare + contexte de régénération post-lésionnelle

  5. Reprogrammation ? Fusion cellulaire ? Homing ectopique? Populations hétérogènes de ¢ souches ? Controverses sur le concept de transdifférenciation

  6. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediatesFD Camargo, R Green, Y Capetenaki, KA Jackson& MA Goodel.Nat Med Dec 2003, 9: 1520-27

  7. Début de la circulation sanguine Sac Vitellin Hématopoïèse Intravasculaire (aorte, artère vitelline) Colonisation du Foie par les précurseurs CD34+ Foie Thymus Moelle Osseuse 3 5 7 9 11 Semaines de gestation Ontogénèse de l’hématopoïèse chez l’homme

  8. La « niche » hématopoïétique Matrice Extra-Cellulaire (Fibronectines, laminines, collagènes, TSP) Chimiokines Cytokines Protéoglycannes CSH Macrophages Endothélium Adipocytes Fibroblastes Myofibroblastes

  9. Compartiment de maturation Précurseurs et cellules matures Compartiment des cellules souches Compartiment des progéniteurs BFU-MK Mégacaryocyte Plaquettes sang BFU-E Érythrocyte Érythroblaste Progéniteur Myélo-érythroïde CFU-GEMM CFU-Baso basophile basophile Mastocyte Granulocytes Myélocytes CFU-Eo éosinophile éosinophile CFU-GM CFU-G neutrophile neutrophile Progéniteur Lympho-myéloïde Cellules souches Pro-Monocyte Monocyte CFU-M Macrophage Cellules dendritiques Pro-B Pré-B Lymphocyte B Progéniteur lymphoïde Plasmocyte Moelle osseuse Pro-NK NK Tissu périphérique Cellule dendritique T auxiliaire Pro-T Pré-T Thymus T cytotoxique Représentation schématique des différents compartiments du système hématopoïétique

  10. MÉTHODES D’EXPLORATION DES CSH • Caractéristiques phénotypiques • Caractéristiques fonctionnelles

  11. I- Caractéristiques phénotypiques des cellules hématopoïétiques humaines Progéniteur Mature Précurseur Différencié Progéniteur Immature CSH Différenciation Différenciation Maturation MARQUEURS IMMUNULOGIQUES CD34+ ou- CD38- Lin- Thy-1- CD34+ CD38- Lin- Thy-1+ CD34+ CD38+ Lin± Thy-1± CD34- CD38+ Lin+ Thy-1- MARQUEURS FONCTIONNELS Quiescente Résistante au 5-FU Rhod 123 faible Quiescente Résistante au 5-FU Rhod 123 faible En cycle Sensible au 5-FU Rhod 123 fort En cycle Sensible au 5-FU Rhod 123 fort

  12. Ag lin (CD13, CD41, GpA, CD71, CD61…) HLA-DR, CD38… CD34 Séquence d’expression des marqueurs Cellules souches Progéniteurs Précurseurs Cellules Matures Granulocyte Lignée Myéloïde Monocyte Erythrocyte Megacaryocyte/Plaquettes Lignée Lymphoïde Eosinophile

  13. ? CSH humaines CSH SRC Cultures à long terme LTC-ICMy, Ly Progéniteurs Tests clonogéniques CFC Caractéristiques phénotypiques Cellules en cours de maturation II - Tests fonctionnels pour l’étude de l’hématopoïèse

  14. SCID-RC (SRC) En pratique : identification des cellules souches humaines 1- Tests in vivo de transplantation xénogénique Irradiation sub-létale (+ anti-CD122) 3 - 4 mois NOD-SCID 2- Tests in vitro de culture Milieu + sérum + stroma 5 - 12 sem LTC-IC 2 sem Milieu semi-solide + cytokines CFC

  15. Fréquence des progéniteurs hématopoïétiques humains dans le sang de cordon ombilical Progéniteurs présents au sein des ¢ mononucléées ¢ CD34+CD38- SRC 1 / 5x105 1 / 600 LTC-IC1 / 2x104 1 / 20 CFC1 / 250 1 / 3

  16. Facteurs extrinsèques et / ou Facteurs intrinsèques REGULATION DES CSH • Détermination • Auto-renouvellement • Différenciation

  17. Représentation schématique du rôle des facteurs de transcription hématopoïétiques aux différents stades de la différenciation HoxB4 Bmi1 C/EBP

  18. Représentation schématique des principales étapes cibles des facteurs extrinsèques Shh Wnt Jagged/Delta

  19. Comment expandre les CSH ? Stimulation Mise en cycle Quiescence Délai Auto-renouvellement Inhibition X Différenciation Apoptose X

  20. FACTEURS DE TRANSCRIPTION : Homéoprotéines : HOXB4 (HOXC4, B3, A9, A10, ...), bHLH : Tal-1/SCL, polycomb : Bmi-1, ... Approches expérimentales pour l’expansion des CSH humaines - CYTOKINES : FLT3-L + TPO + SCF (Kobari et al; Piacibello et al) ± IL-6 + sIL-6R (Ueda et al) - AUTRES FACTEURS SOLUBLES: Shh (via BMP4) (Bhardwaj et al) FGF-1 (de Haan et al) Wnt-5A (Murdoch et al); Wnt-3A (Willert et al) • CELLULES FEEDER (co-cultures + cellules stromales) : • (Connealy et al; Miller & Eaves; .... Dexter)

  21. 6-bromoindirubin-3’-oxime (BIO) X (Dishevelled) (Glycogen synthase kinase-3)   Auto-renouvellement Différenciation Voie Wnt/bCatenine/GSK3 dans les cellules souches

  22. CRU d 12 CFU-S Progéniteurs clonogéniques Cellules matures Contrôle HOXB4 Sauvageau et al., 1995 Effets de sa surexpression sur l’hématopoïèse murine HOXB4 :

  23. 1 2 13 8 9 10 ParaloguesHox PBX1 Coopération MEIS1 TGAT NNAT Fixation à l'ADN (Chang et al 1996; Shen et al 1997) PBX1 HOX Les homéoprotéines agissent sousforme de complexes transcriptionnels HoxB4 + Knock-down de PBX1  CSH « ultra-compétitives »(x 20 par rapport aux cellules surexprimant HoxB4 seul)(J. Krosl et al, 2003)

  24. Effets de HoxB4 dans les CSH humaines(Buske et al. Blood, août 2002; Schiedlmeier et al. Blood, mars 2003) Expression ectopique par transduction rétrovirale (= expression constitutive du transgène) • Augmentation du nombre des cellules greffant dans les souris NOD-SCID (SRC) et des CRU (x 3-4)

  25. Comment expandre les CSH humaines • Sans utiliser de cytokines exogènes * perte de potentiel (?) • Sans transfert de gènes • * mutagenèse insertionnelle • * leucémogénène à long terme ? • * dérégulation de l’hématopoïèse terminale ?  Transduction de la protéine HOXB4

  26. Transport intercellulaire atypique :  sécrétion spontanée et internalisation indépendante de récepteur (formation de micelles inverses) Propriété des homéodomaines La 3ème hélicede l’homéodomaine : - permet la liaison à l’ADN - nécessaire et suffisante pour l’internalisation de la protéine

  27. Résumé de notre travail Amsellem et al, Nat Med, nov 2003 Dans un système de co-culture de CSH humaines avec des cellules stromales sécrétant HOXB4 • La PROTEINE HOXB4 est capable de pénétrer passivement dans des cellules hématopoïétiques • Ce système permet une expansion des cellules hématopoïétiques humaines primitives, sans manipulation de leur génome, par passage passif (et réversible) de la protéine Nouvelle approche pour des protocoles d’expansion ex vivo des CSH humaines

More Related