维生素 B 2 的分子荧光测定一、目的要求１、了解分子荧光分析法的原理。２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。３、掌握荧光光度计的基本操作方法。二、方法原理

维生素B2的分子荧光测定 一、目的要求１、了解分子荧光分析法的原理。２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。３、掌握荧光光度计的基本操作方法。二、方法原理维生素B2又称核黄素,溶于水,在W为0.05的乙酸溶液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm），在所确定的波长条件下，测定维生素B2标准系列溶液的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物样品（蔬菜）中的维生素B2含量。

三、实验步骤 1．标准系列溶液的配制用吸管移取维生素B2标准贮备溶液10.00mL于100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至刻度，摇匀。吸取该稀释溶液(10.0mg·L-1) 0,0.50,1.00,2.00,3.00和4.00mL，分别放入六只100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至刻度，摇匀，此标准系列溶液的浓度分别为0,0.050,0.10,0.20,0.30和0.40 mg·L-1。

2.样品溶液制备 称取50g新鲜蔬菜，加40mL水压汁，将菜汁加入20mL1mol.L-1HCl和10mL水煮沸1h，冷却，不断搅拌滴加2mol.L-1NaOH，调节pH为6，再用稀HCl调节pH至4.5，过滤，用水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

3.工作曲线绘制 取标准系列溶液之一，试验实验条件，找出最佳荧光发射波长。在所确定的波长条件下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光强度与浓度的工作曲线。 4.测定分别吸取10.00mL样品溶液三份，依次置于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋酸，再加入KMnO4溶液(3%)0.5mL，放置2min，边摇边滴H2O2(30%)，使KMnO4刚好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计上分别测定其荧光强

四、结果处理 1.在坐标纸上绘制If~C的工作曲线 2.根据测定的If.x，从工作曲线上查出溶液中维生素VB2的Cx（mg/L） 3.由下式计算出样品（新鲜蔬菜）中的维生素VB2的含量（mg/100g） VB2（mg/100g）= Cx ×25.00×10-3 × （100/10）×（1/WS）×100

五、实验注意事项 1、配制标准系列溶液采用5% HAc溶液定容，配制样品溶液采用蒸馏水定容。 2、用5mL移液管量取2、3、4mL溶液时必须先吸到满刻度； 3、用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长，并确定测定时仪器工作条件（选择合适的灵敏度值与纵坐标放大值）； 4、过滤时先将样品液分批倒入小布袋，用漏斗接液，漏斗下端直接用100mL容量瓶接液； 5、提取液中加10%双氧水应逐滴加入使高锰酸钾刚好颜色褪去（边滴边摇）； 6、样品液测定条件与标准曲线测定条件一致（测定时所用灵敏度值与纵坐标放大值一致）；

维生素 B 2 的分子荧光测定 一、目的要求 １、了解分子荧光分析法的原理。 ２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 ３、掌握荧光光度计的基本操作方法。 二、方法原理