第五章微生物的生长

第五章微生物的生长 　生长是代谢的结果。当同化超过异化，细胞物质量增加，个体重量和体积增大，就是生长。　单细胞的细胞物质增加有限，细胞长大到一定程度就开始分裂繁殖，菌体数量增多，生长多通过繁殖表现出来，以群体细胞数目增加为生长标志。　丝状微生物的生长主要表现为菌丝的伸长和分枝，通常以菌丝的体积和重量增长来衡量生长状况。

第一节微生物纯培养的生长 一、纯培养的分离方法：在实验室条件下得到1个细胞繁殖后代的过程称为纯培养。第一步是分离培养，最常用的分离方法有稀释法、划线法、单细胞挑取法、组织分离法及利用选择培养基分离法等。

一、纯培养的分离方法 • （一）、稀释法： • 1、液体稀释法--首先将待分离的材料接种于培养液中，经培养测定或估计单位容积中的含菌数目，然后进行稀释，使稀释后的一定容积(如两滴或三滴)液体中大约只含一个微生物个体；其次则将已稀释好的菌液接种1滴（0．05ml）至液体培养基试管中，摇匀，静置培养24～48小时后，观察如果管底只出现一个菌落，它可能就是由一个细胞繁殖而成。这种方法适用于细胞较大的微生物。

一、纯培养的分离方法 • 2、固体稀释平皿倾注法--将待分离材料作系列稀释(1:10、1:100……)，分别取不同稀释度的溶液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合摇匀后，倒入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间出现菌落。如果稀释得当，平皿上可出现分散的单个菌落，挑取单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

　　　　　　　稀释倒平皿分离法

一、纯培养的分离方法 • （二）、平皿划线．涂布分离法：用接种环沾取少许待分离的材料，在平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落，这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。用玻璃刮铲代替接种环在平板表面涂布，可得到同样结果。

平皿划线分离法：A.扇形划线;B.连续划线;C.方格划线平皿划线分离法：A.扇形划线;B.连续划线;C.方格划线

一、纯培养的分离方法 • （三）、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞，获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴细菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个细胞后挑取，再接种于培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。

一、纯培养的分离方法 • （四）、组织分离法：主要用来分离高等真菌和某些植物病原菌。取一小块植株或器官组织，用0.1%的升汞(HgCl2)溶液进行表面消毒3～5min，无菌水洗涤数次，移置培养基表面，适温培养。3～5天后，组织块周围出现菌丝生长，确认后，可由菌落边缘挑取部分菌丝转入斜面；对于能产生弹射孢子的高等真菌来讲，可将消过毒的菌盖剪成黄豆大的小块，悬挂在装有PDA培养基的三角瓶内，从而能较快地获得纯培养。

一、纯培养的分离方法 • （五）、利用选择培养基分离法：通过营养物质，生长环境（PH．高温等），化学试剂的特性，配制适合某种微生物生长，而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。 • 有些病原菌可先将其接种至敏感动物，感染后，宿主的某些组织可能含有该种微生物，这样较易得到纯培养。

二、（群体）生长的测定方法 • （一）、细胞数量的测定： • 1、直接测数法或总菌数测定法--单细胞类群。需用细菌计数器或血球计数板(适用于酵母、真菌孢子等)。菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/ｍl )；简便、易操作，难于区分死活细胞及形状与微生物类似的杂质。

（一）细胞数量的测定 • 2、比浊法--在一定浓度范围内，菌悬液中细胞浓度与液体光密度成正比，与透光度成反比。菌数越多，透光量越低。通过光电比色计450-650nm测定光密度或透光率反映细胞的浓度。常用于观察和控制培养过程中微生物菌数的消长情况。如细菌生长曲线的测定和发酵罐中的细菌生长量的控制等。培养液的色调不宜过深，同时菌悬液浓度必须在107/ml以上才能显示可信的混浊度。其优缺点与直接测数法相同。

（一）细胞数量的测定 • 3、稀释平板计数法-- 高度稀释条件下，每一个活的单细胞能繁殖成一个菌落，可以通过菌落数去推算菌悬液中的活菌数。得到的数值往往比直接法数字小。本法是迄今广泛采用的活菌计数方法，具体分为平板涂抹法和倾注法。该法的缺点是程序麻烦，费工费时，而且在混合微生物样品中只能测定占优势并能在供试培养基上生长的类群。

（一）细胞数量的测定 • 4、液体稀释培养计数--将待测样品作一系列稀释，一直稀释到取少量该稀释液（如1ML）接种到新鲜培养基中没有出现生长繁殖为止。最后一级出现菌生长的稀释度称为临界级数，从3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较可靠的结果。

（一）细胞数量的测定 • 例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下：

（一）细胞数量的测定 • 根据上述结果，其数量指标为“541”，查5次重复测数统计表，得近似值为17。乘以第一位数的稀释倍数（105）， • 则原液中的活菌数=17×100000=1.7×106

（一）细胞数量的测定 • 例如：巴氏消毒的牛奶样品作100、 10－1、10－2稀释，各5管重复，分别加1ml样品接种（9＋1）。培养后， 1005管均出现生长， 10－13管生长， 10－2没有生长，其数量指标为530，查表的近似值为7.9，则每毫升牛奶中含活菌数为：7.9 × 100个。

（一）细胞数量的测定 • 5、浓缩法--本法适用于检测微生物数量很少的水和空气等样品。测定时先让定量的水或空气通过特殊的微生物收集装置(如微孔滤膜等)，富集其中的微生物，然后将收集的微生物洗脱后按上法测数，再换算成原来水或空气中的数量。

（二）细胞生物量的测定 • 1、细胞干重法--将单位体积培养液经离心或过滤后收集，用清水反复洗涤菌体，常压105℃、100℃或红外线烘干， 40℃或80℃真空干燥，精确称重，计算培养物总生物量。 • 丝状真菌用滤纸过滤，细菌用醋酸纤维膜等过滤。在琼脂平板上培养的菌体经短时间高温待琼脂溶化后滤出真菌菌丝，洗净、烘干后测干重。一般细菌每1mg干重约等于4～5mg鲜重，4～5×109 个细胞。本法适宜于含菌量高，不含或少含非菌颗粒性杂质的环境或培养条件。

（二）细胞生物量的测定 • 2、总氮量测定法--蛋白质是生物细胞的主要成分，核酸及类脂等中也含有一定量的氮素。已知细菌细胞干重的含氮量一般为12～15％，酵母菌为7.5％，霉菌为6.0％。用化学分析方法（如用硫酸、高氯酸、碘酸或磷酸等消化法）测出待测样品的含氮量，推算细胞的生物量。 • 适用于固体或液体条件下微生物总生物量的测定，需充分洗涤菌体以除去含氮杂质，操作程序较复杂，一般很少采用。

（二）细胞生物量的测定 • 3、DNA含量测定法--微生物细胞中的DNA含量不高(如大肠杆菌约占3%～4%)，比较稳定，可以根据分离出样品中的DNA含量来计算微生物的生物量。如细菌细胞平均含DNA8.4×10-5ng/个

（二）细胞生物量的测定 • 4、代谢活性法--测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物或O2的数量，或者测定微生物代谢过程中的产酸量或CO2量等，均可以在一定程度上反映微生物的生物量。本法系间接法，影响因素较多，误差也较大，仅在特定条件下作比较分析时使用。

三、细菌的群体生长—生长曲线 • 细菌在适宜条件下，若能保证营养供应，及时排出代谢产物将以较高速度繁殖。 • 在有限的液体培养基中，接种少量纯培养细菌，并在培养过程中定时取样测数，以时间为横坐标，菌数的对数为纵坐标，可以绘出一条类似于S形的曲线，这就是细菌的生长曲线。

细菌生长曲线： 1,2.延迟期；3.对数期；4,5.稳定期；6.衰亡期

（一）延滞期(适应期) • 接种到新鲜培养液中，细菌需要重新调整大．小分子组成，以适应环境准备分裂。 • 通常表现为个体变长，体积增大和代谢活跃，RNA含量增加使细胞质的嗜碱性增强，贮藏物消失；细胞对外界理化因子的抵抗能力减弱。 • 增殖率与死亡率相等，均为零；菌数曲线平稳。 • 延滞期长短取决于遗传特性、菌龄及接种前后培养条件的差异等。细菌、酵母菌短，霉菌次之，放线菌最长。对数期菌种可缩短乃至消除延滞期。

（二）对数期(指数期) • 生长旺盛，代谢活力增强，分裂速度加快，菌数以几何级数增加，代时稳定，活菌数与总菌数非常接近，曲线为一条上升的直线。 • 以细菌为代表，Nt＝No2n ；ｎ为to到ｔ繁殖代数。如果用G来表示世代时间(或倍增时间):即群体细胞数量增加一倍需要的时间，则：G＝(t-to)/n (1)ｎ= log（Nt/ No）/0.301 (2) • G＝0.301(t- to)/log（Nt/No） (3) • 测No、Nt．ｔo、ｔ，计算世代时间。

（二）对数期(指数期) 一般不超过40代。影响世代时间主要有3种。 • 1、菌种　漂浮假单胞菌9.8min，密螺旋体33ｈ。 • 2、营养--丰富则代时短。浓度很低时，影响生长速率；浓度增高，影响最终菌体产量；提高到一定浓度，则生长速率和菌体产量两者均不受影响。凡是处于较低浓度范围内，影响生长速率和菌体产量的营养物，就称为生长限制因子。 • 3、培养温度-

（三）稳定期 • 在对数末期，营养物质逐渐消耗，有生理毒性的代谢产物积累及pH和Eh等不利变化，生长速度降低，增殖率下降而死亡率上升，当两者趋于平衡时，就转入稳定期。 • 活菌数最高，基本稳定并可相对持续一定时间。个体较小并开始累积贮藏物和特殊的次生代谢产物，芽孢细菌则开始形成芽孢。 • 稳定期长短与菌种和环境有关，发酵工业通过补料。调节ｐH、温度或通气量等延长稳定期。

（四）衰亡期（衰老期） • 稳定期后，营养和环境进一步恶化，死亡率迅速增加，以致明显超过增殖率，尽管群体的总菌数仍然较高，但活菌数急剧下降，其对数与时间呈反比，表现为按几何级数下降，生长曲线直线下垂。又称为对数死亡期。 • 细胞多形态，大小或形态变异的畸形或退化型，革兰氏染色不稳定，许多G+细菌的衰老细胞可能表现为G-。

四、分批培养 • 将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，称为分批培养。 • 培养料一次加入，不补充和更换。随着生长，营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，对数期不可能长时间维持。

五、连续培养 • 在培养器中不断补充新鲜营养物质，并以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，从理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流动量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变,此种方法就叫连续培养法。 • 连续培养可随时为微生物研究提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平，已成为当前的发展方向。

连续培养装置A.恒浊培养系统；B.恒化培养系统1.无菌培养基容器；2.控制流速阀；3.培养室；4.排出管；5.光源；6.光电池； 7.流出物

五、连续培养 • （一）、恒浊连续培养：不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。装有浊度计，借光电池检测培养浊度(即菌液浓度)，根据光电效应的电信号变化，自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。培养基含过量必需营养物时，可维持菌体最高生长速率。 • 为了获得大量菌体以及与菌体相平行的代谢产物时，使用此法具有较好的经济效益。

五、连续培养 • （二）、恒化连续培养：控制恒定的流速，使营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率。营养物浓度低，才影响生长速率，一定范围内，生长速率与营养物的浓度成正相关。 • 必须将某种必需的营养物质（氮．碳源及生长因子，无机盐等）控制在较低的浓度，作为限制因子，而其他营养物均为过量，使生长速率取决于限制性因子浓度。通过自动控制系统保持限制因子的恒定流速，不断予以补充，使细菌保持恒定的生长速率。浓度不同的限制性营养物，可以得到不同生长速率的培养物。

营养物浓度对生长速率的影响

六、同步生长 • 在分批培养中，细菌群体能以一定速率生长，但所有细胞非同时分裂，细胞不处于同一生长阶段，生理状态和代谢活动也不完全一样。如果以群体测定结果的平均值代表单个细胞就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，即单细胞同步培养技术。

六、同步生长 • 能使培养的微生物比较一致，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法，这种生长方式叫同步生长，所得到的培养物叫同步培养或同步培养物。 • 同步培养常用以下3种。 • （一）、机械法(又称选择法)： • （二）、调整生理条件同步法： • （三）、抑制DNA合成法：

细菌的同步生长与非同步生长

六、同步生长 • （一）、机械法(又称选择法)： • 1、离心沉降分离法- • 2、过滤分离法 • 3、硝酸纤维素薄膜法— • 机械法不影响细菌代谢，菌体生命活动较为正常。有些微生物即使在相同的发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，采用这类方法。

（一）机械法(又称选择法) • 1、离心沉降分离法— • 生长阶段不同，个体大小不同。 • 离心使大小不同的细胞群体在一定程度上分开。 • 用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。

（一）机械法(又称选择法) • 2、过滤分离法— • 应用孔径大小不同的微孔滤膜，可将大小不同的细胞分开。 • 用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。 • 用适宜孔径的微孔滤膜，将不同步的大肠杆菌群体过滤，刚分裂的幼龄菌体较小，能够通过滤孔，其余菌体都留在滤膜上面，将滤液中的幼龄细胞进行培养，就可获得同步培养物。

（一）机械法(又称选择法) • 3、硝酸纤维素薄膜法— • 将菌液通过硝酸纤维素薄膜。细菌与滤膜带有不同电荷，能使细菌附着于膜上； • 翻转薄膜，再用新鲜培养液滤过培养； • 附着于膜上的细菌进行分裂，分裂后的子细胞不与薄膜直接接触，由于菌体本身的重量，加之菌体附着的培养液重量，下落到收集器内； • 收集器在短时间内收集的细菌处于同一分裂阶段，培养后，得到同步培养物。

硝酸纤维素薄膜法

（二）调整生理条件同步法 • 又称诱导法：主要通过控制环境条件诱导同步生长。 • 1、温度调整法 • 2、营养条件调整法 • 3、用稳定期的培养物接种 -2、营养条件调整法 2、营养条件调整法

（二）调整生理条件同步法 • 1、温度调整法--将培养温度控制在接近最适温度一段时间，缓慢进行新陈代谢，但又不进行分裂（使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制），然后将培养温度调整到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分裂。

（二）调整生理条件同步法 • 2、营养条件调整法--控制营养物浓度或组成以达到同步生长。诱导因子必须不影响生长但可特异性地抑制细胞分裂，当移去(或消除)该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。 • 例如将大肠杆菌胸腺嘧啶缺陷型菌株，培养在不含胸腺嘧啶的培养基内一段时间，所有的细胞在分裂后，由于缺乏胸腺嘧啶，新的DNA无法合成而停留在DNA复制前期，随后在培养基中加入适量胸腺嘧啶，所有细胞都同步生长。

（二）调整生理条件同步法 • 加入某种抑制蛋白质合成的物质(如氯霉素)，诱导一定时间再转到另一种完全培养基中培养； • 用紫外线处理，对光合性菌体采用光照与黑暗交替处理法等，可达到同步化。 • 诱导芽孢杆菌在同一时间内萌发，得到同步培养物。

（二）调整生理条件同步法 • 3、用稳定期培养物接种 • 处于稳定期的细胞，由于环境条件的不利，细胞均处于衰老状态，移入新鲜培养基中，可得到同步生长。

（三）抑制DNA合成法 • DNA的合成是一切生物细胞进行分裂的前提。利用代谢抑制剂阻碍DNA合成一段时间，然后再解除抑制，也可达到同步化的目的。 • 氨甲蝶呤、5-氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞DNA合成的同步化均有作用。10~-6mol/L氨甲蝶呤或5-氟脱氧尿苷处理培养物，在16小时内可以抑制DNA的合成。加入4×10~-6mol/L的胸腺苷，解除这种抑制，细胞即可进行同步化生长。

第五章 微生物的生长