第一节 含生物碱类成分的分析 一、含生物碱类成分中药制剂的定性鉴别 ( 一 ) 生物碱的沉淀反应

1. 第一节 含生物碱类成分的分析 一、含生物碱类成分中药制剂的定性鉴别 (一)生物碱的沉淀反应 (1)生物碱的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加硅钨酸、磷钨酸、磷钼酸试剂数滴，生成（BH+）4[Si（W3O10）4]沉淀（淡黄色或灰白色）、3BHPO412WO32H2O沉淀（白色至褐色）、3BH3PO412MoO32H2O 沉淀（白色至黄褐色，加氨水转变为兰色）。 (2)生物碱的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加碘-碘化钾试剂数滴，产生棕色或褐色沉淀， BH+ + I2-K+I- → BI2HI（棕、褐色） + K+ (3)生物碱的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加碘化铋钾、碘化汞钾试剂数滴，产生红棕色沉淀、类白色沉淀。 BH+ + BiI3KI → BBiI3HI（红棕色） + K+ BH+ + HgI2KI → BHgI22HI（类白色） + K+

2. (二)生物碱的色谱鉴别 1．薄层色谱法 首先用适当的溶剂提取生物碱，提取液经浓缩后直接或经过必要的净化后，点在薄层板上，层析后喷洒生物碱显色剂，再根据生物碱的特性，选择特异的颜色反应或荧光，并应用纯品对照，或标准药材对照，同时须作阴性对照后确定。如用硅胶为吸附剂时，一般应用碱性系统展开剂较多，或使生物碱的薄层分离在碱性环境下进行。 2．纸色谱法 多为薄层色谱所代替，利用多缓冲纸色谱来快速鉴别乌头中双酯类生物碱和醇胺类生物碱有其独到之处。 3．高效液相色谱法 在恒定的高效液相色谱条件下，各种生物碱都具有一定的保留时间，可作为定性鉴别的参数。一般要求取得两个色谱系统的保留时间，或应用二级管阵列检测器作出鉴定。 4．气相色谱法 适用于具挥发性且过热不分解的生物碱分离和鉴定，目前在应用上有一定的局限性。

3. 二、含生物碱类成分中药制剂的含量测定 (一)经典化学方法 1.重量法 重量法测定中药制剂中生物碱多为测定其总生物碱的含量。本法可用于混合总碱、未知结构或分子量相差较大的生物碱的含量测定。缺点是挥发性生物碱不宜用此法，在蒸发提取溶剂或加热、干燥时能分解破坏以及加碱使生物碱游离时可发生水解的生物碱也不可用此法。本法取样量大，得到的残渣在称量的准确度内方可应用。应用本法要求定量的将生物碱提取完全，并尽可能除去杂质，须注意选择合适的提取溶剂。 实例 见P135 苦参片中苦参总碱的测定 2．容量法 (1)酸碱滴定法： a.游离生物碱不溶于水，可先将生物碱溶于过量标准酸溶液中，再用标准碱溶液回滴。 b.游离生物碱能溶于水或水-乙醇溶液中的可直接滴定。 c.生物碱盐在水或乙醇介质中，用强碱溶液滴定。一般使其溶于90％乙醇溶液中，可用标准碱乙醇液滴定，用酚酞作指示剂。

4. (2)两相滴定法：因边滴边使游离生物碱溶于有机溶剂中，不致影响终点的观察。更重要的是由于游离生物碱进入有机相，明显地增大了生物碱盐的电离常数pKa。生物碱盐在两相中的水解为 pKa(D)=pKa - log(1+PC)，即与分配系数有关。一般的测定方法是称取生物碱盐类溶于水中(加氯化钠少许)，然后加一定量有机溶剂，用氢氧化钠标准溶液进行滴定，并不断搅拌振摇。常用的有机溶剂有氯仿、乙醚等，以氯仿用的较多，常用的指示剂如酚酞。 如滴定剂选用酸性染料作为生物碱的两相滴定，则称之为酸性染料滴定法。利用在一定的pH条件下，酸性染料能与生物碱结合而定量地被有机溶剂提出，当滴定到达终点时，由于稍过量的酸性染料，使水层产生颜色而指示终点。为了保证酸性染料与生物碱的结合，可在水层中加入缓冲溶液。 BH+ + In- → BHIn 本方法测定生物碱含量时，应注意选择合适的pH、合适的酸性染料和合适的有机溶剂。 酸性染料现以溴酚蓝、溴麝香草酚蓝及溴甲酚绿应用较多。有机溶剂应用最多的是氯仿，其次是苯和二氯乙烷。要求有机溶剂应对生物碱与酸性染料结合物有很好的溶解度。

5. (3)络合滴定法： 重金属盐类如碘化铋钾、碘化汞钾和碘化镉钾等可使生物碱或其盐生成沉淀，将沉淀溶解，然后用络合滴定剂直接滴定原来沉淀中的重金属；或者滤出沉淀，滴定滤液中剩余的过量的重金属而求得生物碱含量。本测定方法手续繁琐，目前仅应用于原料药材的生物碱含量测定，在中药制剂中应用较少。 (4)沉淀容量法： 利用多数生物碱与硅钨酸、雷氏盐、四苯硼钠等试剂，生成沉淀，组成一定，直接或间接测定其含量。例如生物碱或其盐类与一定量四苯硼钠溶液作用，过量的四苯硼钠用阳离子表面活性剂如氯化十六烷基吡啶或氯化烃基二甲基苄基铵溶液回滴过量的四苯硼钠，以溴酚蓝为指示剂，终点时多一滴以上季铵盐溶液与溴酚蓝生成鲜蓝色络合物以指示终点，此方法亦多用于原料药材的生物碱含量测定。

6. (二)光谱法 (1)雷氏盐比色法：生物碱与雷氏盐生成沉淀后，将沉淀分离，溶于丙酮，于520～526nm波长处比色测定吸收度，换算生物碱的含量。经实验证明生物碱的雷氏盐沉淀的丙酮溶液所呈现的吸收特征，是由于分子结构中的硫代氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱部分，其吸收值与样品或溶剂无关。硫代氰酸铬铵在丙酮中的克分子吸收系数为106.5(单盐)或213.0(双盐)。故可根据其吸收值A按下式直接测得样品重而不需绘制标准曲线。 W =（ A/ε）×M×V/1000 式中，M：生物碱雷氏盐沉淀的分子量，W：生物碱雷氏盐沉淀的重量；A：吸收度；ε：克分子消光系数；V：丙酮毫升数。 本方法可不需要标准对照品，但需注意生物碱生成单盐或双盐，并要注意样品的净化。

7. (2)酸性染料比色法：在一定pH的介质中，生物碱B与氢离子H+结合成盐(BH+)，与某些酸性染料的阴离子In-结合成有色化合物[BH+In-]，它能定量的被有机溶剂提取出来，此结合物碱化或酸化后，即定量放出染料可进行比色，或测定该有色的有机溶液。(2)酸性染料比色法：在一定pH的介质中，生物碱B与氢离子H+结合成盐(BH+)，与某些酸性染料的阴离子In-结合成有色化合物[BH+In-]，它能定量的被有机溶剂提取出来，此结合物碱化或酸化后，即定量放出染料可进行比色，或测定该有色的有机溶液。 此方法的关键：选择合适的pH、合适的酸性染料和合适的有机溶剂。含有1个N原子的生物碱与酸性染料(溴酚蓝)生成分子1∶l的结合物，与2个N原子的生物碱生成分子1∶2的结合物(pH应较低pH3.0 ～5.8)。此外，应防止操作时混入水分。同时也须注意带入水相中过量染料影响测定的结果。 实例 P147 延胡索乙素酸性染料比色法

8. (3)苦味酸盐法：凡是在弱酸或中性溶液中能与苦味酸定量发生沉淀的生物碱，都可按本方法测定含量。(3)苦味酸盐法：凡是在弱酸或中性溶液中能与苦味酸定量发生沉淀的生物碱，都可按本方法测定含量。 a.是滤取生物碱-苦味酸盐沉淀，加碱使生物碱-苦味酸盐解离，然后以有机溶剂提出生物碱，将苦味酸的碱性水溶液进行比色，再换成生物碱的含量。 b. 是在pH为7的缓冲液中，使生物碱与苦味酸结合成盐，用氯仿提取此盐，然后再以pH为11的碱性缓冲液使氯仿中苦味酸盐解离，并将苦味酸提取到碱性水溶液中再进行比色。 c.是直接在pH为4～5的缓冲溶液中，用氯仿提取生物碱苦味酸盐，将氯仿提取液直接进行比色。 （4）其他 如色谱-光谱连用技术、导数光谱法等 实例： P141 小檗碱的紫外分光光度法 P145 麻黄碱的测定（Cu2+-二硫化碳法）

9. (三)色谱法 1．高效液相色谱 生物碱类成分进行高效液相色谱分析时，可采用正相、反相和离子对色谱，其中以反相高效液相色谱应用较多。在反相高效液相色谱中为了克服游离硅醇基的影响，采取了以下的措施， (1)流动相方面的改进： a.加入硅醇基抑制剂，最常用的硅醇基抑制剂是三乙胺; b.在流动相中加入离子对试剂; c.在流动相中加入季铵盐试剂，例如在水-甲醇流动相中加入0.01mol／L的溴化四甲基胺。 机理是流动相不断地流入色谱柱后，即连续地添加掩蔽性试剂(季胺盐)，被分离的碱性化合物和硅醇基之间的相互作用被阻碍，从而使生物碱类成分得到很好的分离。流动相中水-甲醇比例的改变以及pH的变化都不影响峰的对称性。 (2)固定相方面的改进：选择碳链较短的键合相硅胶填料，例如C8比C18好。 (3)增加流动相的脂溶性。 (4)调整流动相的pH值,pH>pKa+1或<pKa-1条件下用离子对试剂。 (5)升高柱温。

10. 基本流程 1）样品供试液制备： 样品根据生物碱通性提取、净化、定容制备供试液。（如利用生物碱溶于氯仿，生物碱盐不溶于氯仿，通过萃取与反萃取达到提取净化，再定容后制成样品供试液）。 2）标准液配制：先配成标准储备液，再配制成系列标准液。 3）系统适应性： 色谱柱、流动相、流速、检测器、测试波长等。 4）选择定量方式，并相应进样、检测、计算含量。 实例： P142-143 小檗碱的HPLC分析 P145-146 麻黄碱与伪麻黄碱的HPLC分析

11. 2．薄层色谱法 薄层色谱技术在生物碱类成分分离和测定须结合生物碱的通性选择合适的提取溶剂制成供试品溶液，需要采用化学方法提取和纯化，常用液-液萃取或液-固萃取，或结合生物碱的特性进行纯化。常使用碱性展开剂或在碱性气氛中展开。在薄层直接扫描定量时，须首先作一工作曲线，目的是考察工作曲线是否为通过原点的直线，以便决定采用外标一点法或外标两点法进行定量，其次需要找出线性范围，以便摸索样品点样量。采用薄层直接扫描定量还需要随行对照品进行，同时要考察稳定性，同板、异板效应和精密度等。 实例 安宫牛黄丸 1）小檗碱的TLC-比色法 2）小檗碱的TLC扫描法 P142 胃特灵、沉香舒气丸中延胡索乙素的TLC法 147

12. 3．气相色谱法 气相色谱法适用于有挥发性的，遇热不分解的生物碱类。游离碱或盐都只能得到一个游离碱的色谱峰，但生物碱盐在急速加热器中产生的酸对色谱柱和检测器不利，所以一般多经提取后进柱。例如麻黄碱、苦参碱和颠茄类生物碱。 实例 疏风定痛丸中麻黄碱含量测定 P144

13. 第二节 黄酮类制剂的分析 一、含黄酮类成分的定性鉴别 定性鉴别方法主要有化学显色反应，纸色谱和薄层色谱 (一)化学显色反应 1.还原反应盐酸-镁粉反应显色反应的机理是黄酮类成分经还原反应后生成花色甙元及其二聚物。 定性鉴别的操作：将中药制剂用适当方法提取分离。组分较少的制剂可用有机溶剂提取，常用的溶剂有甲醇、乙醇或乙酸乙酯；取样品液5～10mL，加入数滴盐酸，然后加入少许镁粉，如果有黄酮、黄酮醇或其二氢化合物存在，数分钟后则可产生橙色或红色。必要时，需作空白试验。

14. 2．与金属盐类试剂的络合反应 黄酮类成分能与金属离子如Al3+，Zr4+等产生络合作用，产生荧光或颜色加深等。 络合作用的条件是黄酮类成分必须具备下述条件之一，即5-羟基(a)、3-羟基(b)或邻二酚羟基(c)，(a)、(b)都是羟基与4位羰基共同与金属离子形成络合物。 三氯化铝、硝酸铝和二氯氧锆的醇溶液常作为黄酮类成分的重要定性试剂及薄层与纸层析的显色剂。

15. (二)纸色谱法 黄酮类成分纸色谱的溶剂系统可归纳为酸性溶剂与中性溶剂系统两个方面。 酸性溶剂系统 是多种不同比例量的混合酸性溶剂，对绝大多数黄酮成分的分离，均能取得适当的Rf值，分离较好，色点扩散也小，尤以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)应用最为普遍。此外，适当浓度的稀释乙酸如乙酸-水(6∶4)也能得到较满意的分离，尤以黄酮甙类结果更好。假若增加乙酸浓度，一般可以使游离黄酮类的Rf值增大。 中性溶剂系统 是用水和有机溶剂组成的。利用水对各种黄酮及其甙类不同的溶解度，易于产生化合物间分配系数的差别。乙酸乙酯-水，氯仿-水，正丁醇-水等，都是实用的溶剂系统。

16. (三)薄层色谱法 黄酮类成分的薄层定性，一般采用吸附薄层，常用的吸附剂有硅胶与聚酰胺，也有用纤维素、硅酸镁、氧化镁。 硅胶色谱分离弱极性化合物较好 聚酰胺色谱分离含游离酚羟基的黄酮及其甙较理想 纤维素薄层则适用于分离多糖甙混合物 展开后的显色反应可采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配合的方法。

17. 1．硅胶薄层色谱 用硅胶分离黄酮成分遵循正相色谱层析规律，化合物极性越强，所需溶剂的极性越大。 其Rf值顺序如下：RCH3>RH>ROCH3>R-O-糖>ROH 常用的溶剂系统有： 甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，分离黄酮甙元；苯-甲醇(95∶5)，分离黄酮甙元； 苯-甲醇-乙酸(35∶5∶5)，分离黄酮甙； 氯仿-甲醇(8∶2)，分离黄酮甙元及甙； 苯-乙酸乙酯(7.5∶2.5)或苯-丙酮(9∶1)，分离黄酮甙元衍生物如甲醚或乙酸酯中性成分； 甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，分离双黄酮成分。 溶剂系统中各组分的配比可根据薄层色谱的需要加以调整。

18. 实例 淫羊藿的鉴别 供试液制备 取本品粉末0.5g，加50％乙醇30ml置水浴上回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干乙醇后，加水少量溶解，加至聚酰胺小柱上，先后用水，乙醇各lOOml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣用乙醇溶解，使成1ml，作为供试品溶液。 对照液制备 取淫羊藿甙对照品，用乙醇制成0.5mg/ml的溶液。 薄层板 硅胶G加0.1M Na2HPO4的0.3％CMC-Na+自制板；厚度：250um 点样 供试品溶液10uL，对照品溶液2uL；条带状点样。 展开剂 醋酸丁酯-甲酸-水(1.3∶1∶1)10℃以下放置后的上层溶液。 展开方式 展开剂预平衡15分钟；上行展开；展距：8cm 显色 喷以5％AlCl3乙醇溶液，105℃加热约数分钟后，置紫外光灯(365nm)下检视。 色谱识别 供试品色谱中，在与淫羊藿甙对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点。 注意事项 温度在25℃以上；控制湿度在18-47％范围内色谱效果较好。

19. 1 2 3 4 5 6 样品：1.淫羊藿甙 2.淫羊藿 3.箭叶淫羊藿 4.朝鲜淫羊藿 5.柔毛淫羊藿 6.巫山淫羊藿

20. 2．聚酰胺薄层色谱 聚酰胺薄层色谱用于分离含游离酚羟基的黄酮甙与甙元较好。由于各种黄酮类成分取代基团的性质、多少和位置的不同，与聚酰胺形成氢键的能力有所差异而得到分离。 一般说来，展开剂中大多含醇、酸、水，或二者兼有。常用的溶剂系统有：甲醇-水(8∶2)，分离黄酮甙元及甙，乙醇-水-乙酰丙酮(2∶4∶1)，水-乙醇-丁酮-乙酰丙酮(13∶3∶3∶1)，苯-丁酮-甲醇(6∶2∶2)，分离黄酮甙元；甲酸-甲醇-乙酸乙酯(1∶21∶8)，乙酸-水(1∶2)，分离黄酮甙。 如鼻炎康片中黄芩甙的薄层色谱。取片剂细粉，加50％乙醇于60℃水浴中热浸30分钟，滤过，取滤液点于聚酰胺薄膜上，用36％醋酸展开，以黄芩甙为对照品，展开后于紫外灯下观察（365nm)，黄芩甙呈紫色斑点，Rf值约为0.30。

21. 3．纤维素薄层色谱 纤维素薄层色谱可用于分离黄酮甙类较好，原理与纸色谱相同，色谱流动相可套用纸色谱所有的流动相。 常用的展开剂有， (1)正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)。 (2)2％甲酸；不同浓度的乙酸(6％、10％、40％、60％)；乙酸乙酯-甲酸-水(8∶2∶3，上层)。 (3)异丙醇-氢氧化铵-水(8∶1∶1)。 a.黄酮类成分的纤维素色谱行为是：分子中酚羟基增多时，无论用上述任意一溶剂系统Rf值均减少；当分子中羟基为甲基或甲氧基所取代时，Rf值增加， b.黄酮甙分子中醇羟基增多，用不同浓度的乙酸展开，Rf值增加，而用正丁醇乙酸水系统则相反。

22. 二、黄酮类成分定量分析 (一)比色法 最常用的是与铝盐反应，试剂为三氯化铝和硝酸铝。测定总黄酮时常用芦丁作对照品。 实例 降压丸中芦丁的测定---铝盐络合比色法 标准曲线制备 精密吸取芦丁液分别置于25ml量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠1.0ml，混匀，放置6分钟，加入10％硝酸铝1.0ml，混匀，放置6分钟，加入4％氢氧化钠溶液10.0ml，用水稀释至刻度，混匀，放置15分钟，在500nm处分别测定吸收度。以吸收度为纵坐标，对照品液体积为横坐标绘制标准曲线。

23. 供试品测定 将丸剂粉碎，精密称取相当于1.0g槐米的细粉，置于索氏提取器中，加入60ml乙醚，回流至无色，放冷，除去乙醚，再加甲醇60ml回流提取至无色，放冷。将甲醇提取液转移至100ml量瓶中，定容。精密吸取10m1，置于另一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。精密吸取3.0ml于25ml量瓶中，再按标准曲线项下“加5％亚硝酸钠1.0ml……”操作，测定吸收度，再从标准曲线中查出相当于芦丁对照品液的体积，应用下列算式计算芦丁的含量。 芦丁%=V×F ×100%/（3 ×W）

24. （二)紫外分光光度法 黄酮类化合物吸收带I在较长波长(330～380nm)，是由B环的桂皮酰基所引起的；Ⅱ带在较短波长(240～280nm)，系A环的苯甲酰基所引起的。最大吸收波长范围因各类型结构不同而异， a.黄酮、黄酮醇 I带330～350nm，Ⅱ带250～270nm； b.双氢黄酮 I带吸收弱310～330nm，Ⅱ带275～290nm； c.异黄酮 无I带吸收， Ⅱ带250～270nm； d.查耳酮 I带360～390nm，Ⅱ带吸收较弱240～260nm。 一般随共轭程度和羟基数目的增加，吸收带向长波移动。 中药制剂的成分复杂，一般需经过适当的提取分离(如正丁醇、乙酸乙酯萃取，聚酰胺柱、C18柱分离）后，才能进行定量分析。

25. 实例： 1.复方芦丁片中芦丁的测定——单波长分光光度法 2.银黄注射液中黄芩甙和绿原酸的测定——联立方程法 P156 A276 = A黄276 + A绿276 =ε黄276 C黄L +ε绿276 C绿L A324 = A黄324 + A绿324 =ε黄324 C黄L +ε绿324 C绿L L = 1cm C黄=(ε绿324 A276 -ε绿276 A324 )/(ε黄276ε绿324 -ε黄324ε绿276 ) C绿=(ε黄324 A276 –ε黄276 A324 )/(ε绿276ε黄324 -ε绿324ε黄276 )

26. (三)薄层色谱法 薄层色谱法测定中药制剂中单体黄酮类成分的关键是分离。样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶、纤维素或聚酰胺进行层析，以达到分离的目的。 层析后可TLC-比色法测定；也可以用薄层扫描仪直接测定。 实例1 银黄注射液中黄芩甙的测定----TLC-比色法 实例2 枳实导滞丸中橙皮甙的测定----荧光薄层扫描法

27. (四)高效液相色谱法 黄酮类成分的RP-HPLC：大多用C18键合相，流动相常用甲醇-水-乙酸(或磷酸缓冲液)及乙腈-水。 实例 1.生脉注射液中麦冬高异黄酮的测定 2.海马补肾丸中淫羊藿甙的测定 3.鼻炎康片中黄芩甙的测定 4.复春片中淫羊藿甙的测定。 5. 香砂养胃丸中橙皮甙的测定

28. 黄酮类成分的NP-HPLC： a.无羟基的黄酮类化合物或乙酰化黄酮类化合物，固定相为硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。 b.乙酰化黄酮、有一个羟基的黄酮类成分，采用-CN键合相色谱，流动相为乙烷-氯仿。 c.含有2个以上羟基的黄酮类成分可选用-NH2键合相，流动相可选用二氧六环-二氯甲烷(1∶9)。

29. 第三节 皂甙类制剂的分析 一、皂甙类成分的定性分析 (一)泡沫反应 取中药材粉末约1g，加水10ml，煮沸10分钟后过滤，将滤液于试管内强烈振摇，如产生持久性泡沫(15分钟以上)即为阳性反应。所产生的泡沫多少与pH有关，取2支试管，一管加入0.1mol/L盐酸液5ml，另一管加入0.1 mol/L氢氧化钠液5ml，再各加入中药水溶液，使酸管的pH为1，碱管pH为13，强烈振摇，如两管所形成的泡沫高度相同，则中药中含三萜皂甙，如碱管泡沫较酸管泡沫高数倍，则中药中含甾体皂甙。

30. (二)显色反应 1。醋酐-浓硫酸反应 取含皂甙样品置试管中，加醋酐1ml溶解后，沿试管壁加入少量浓硫酸，在两液层中间出现色环，甾体皂甙生成蓝色或蓝黑色，而三萜皂甙则出现红、粉红或紫色。 2．三氯醋酸反应 取皂甙溶液滴在滤纸条上，滴三氯醋酸试剂，加热到60℃，若斑点生成红色渐变为紫色，则样品为甾体皂甙；若需加热到100℃才出现以上颜色变化，则样品为三萜皂甙。 3．氯仿-浓硫酸反应 样品溶解于氯仿，沿管壁滴加浓硫酸后，在氯仿层呈现红或蓝色，并有绿色荧光出现。 4．冰醋酸-乙酰氯反应 样品溶于冰醋酸中，加入乙酰氯数滴及氯化 锌结晶数粒，稍加热，则呈现淡红色或紫红色。 5．五氯化锑反应 样品加五氯化锑的氯仿液呈紫蓝色。

31. (三)薄层色谱 皂甙类成分进行薄层分离时采用吸附剂常用的是硅胶或氧化铝以及特殊需要的硅藻土。 亲水性强的皂甙通常要求硅胶的吸附活性较弱些，展开剂的极性要大些，才能得到较好的分离效果。常用的溶剂系统有：氯仿-甲醇-水(13∶7∶2，下层)、正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)等。 皂甙元的极性较小，如以硅胶为吸附剂，展开剂的亲脂性要求强烈，所用的溶剂系统常以苯、氯仿、己烷、异丙醚等为主要组分，再加以少量其他极性溶剂。常用的溶剂系统有环己烷-乙酸乙酯(1∶1)、苯-乙酸乙酯(1∶1)、氯仿-乙酸乙酯(1∶1)等。

32. 薄层色谱后，皂甙类化合物常用的显色剂： (1)25％磷钼酸乙醇溶液：喷后置140℃加热5～10分钟，皂甙元均呈深蓝色，灵敏度高(0.5μg即能显色)，不易褪色。 (2)三氯化锑的浓盐酸或氯仿溶液：喷后在90℃烤10分钟，因有毒性，应在通风橱中进行，加热后不同的皂甙元在可见光或紫外光下显出不同种颜色，有助于鉴别皂甙元。 (3)硫酸-甲醇(1∶1)：喷后加热，显红褐色、紫色、黄色或黑色，与加热温度有关。

33. (4)氯磺酸-乙酸(1∶2)溶液：喷后130℃加热5分钟，各种皂甙元显不同颜色，如天蓝、紫、粉红、淡棕色等，在紫外光灯下也显不同荧光，比较灵敏，可检出10-1～10-3μg，可用于鉴别和定量。(4)氯磺酸-乙酸(1∶2)溶液：喷后130℃加热5分钟，各种皂甙元显不同颜色，如天蓝、紫、粉红、淡棕色等，在紫外光灯下也显不同荧光，比较灵敏，可检出10-1～10-3μg，可用于鉴别和定量。 (5)碘蒸气：灵敏度约为1～2μg，碘的优点是易挥发，显色后挥去碘，斑点可作定量分析，常用于确定斑点位置。 注：皂甙类化合物的薄层色谱鉴别往往要求控制相对湿度与温度，如三七皂甙在10℃以下展开，可与人参皂甙Re分开，在室温展开则不能使两者分开。一般可控制展开温度在20 ℃以下，相对湿度在47%左右。

34. 实例 人参 三七 西洋参 的薄层鉴别 供试液制备 取本品粉末1g，加氯仿40ml，置水浴回流1小时，弃氯仿液，药渣挥干，加水饱和正丁醇10ml，超声处理30min，取上清，加氨试液三倍量，摇匀，放置分层，取上层正丁醇液蒸干，加甲醇溶解制成1ml供试液。 对照液制备 取人参皂甙Rb1，Rb2，Rc，Re，Rd，Rg1，Rf对照品和伪人参皂甙 F11对照品，加甲醇制成每lml各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。 薄层板 硅胶60预制板(Merck)

35. 点样 供试液与对照液分别点样1ul 展开剂 氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15  40  22  10)10℃以下放置后的下层溶液。 展开方式 展开剂预平衡15分钟；上行展开；展距：12-14cm 显色 喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热数分钟至斑点显色清晰， 置紫外光灯(365nm)下检视荧光色谱。 色谱识别1.人参皂甙Rf为人参含有，西洋参不含，可作为人参与西洋参的区别依据之一；2．西洋参含的人参皂甙Fll，人参不含，可作为西洋参的鉴别特征；3.生晒参与红参之区别，在于Rgl以上的“微量皂甙”，红参较生晒参明显。4.三七色谱较简单，最明显的是Rbl，Re，Rgl三个主斑。需注意的是Re斑点与三七皂甙R1重叠。

36. 样品：1-2．生晒参； 3-5．红参； 6-9．朝鲜红参； 10-12．西洋参(进口)； 13-14．西洋参(国产)； 15．三七； 16．人参皂甙对照品Rb1(S1)，Rb2(S2)，Rc(S3)，Re(S4)，Rd(S5)， Rg1(S6)，Rf(S7)， Fll(S8)。

37. 二、皂甙类成分的定量分析 总皂甙的含量测定一般需用适当的溶剂提取，如甲醇(80％～95％)、乙醇等，提取后经分离（如水饱和的正丁醇萃取，大孔吸附树脂经处理后溶剂洗脱）得到总皂甙成分，再根据皂甙类化合物的各自特征来选择含量测定方法。最常用的方法是比色法。 皂甙元的含量测定时可按总皂甙的提取分离方法得到总皂甙，再加酸(如硫酸、盐酸)加热水解，得到皂甙元；也可以将样品先行水解，再用有机溶剂从水解后的混合液中提取皂甙元。测定皂甙元含量的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和比色法。 单体皂甙的含量测定方法主要为薄层色谱法和高效液相色谱法。

38. (一)比色法 常利用皂甙能与某些试剂反应后产生颜色，然后于可见光区进行比色测定常用的皂甙显色试剂有： 浓硫酸 可以作为测定皂甙元的一种通用试剂，甾体皂甙元与浓硫酸反应常显黄色，但需在较高温度(80～90℃)反应30～60分钟。 高氯酸 用于测定有Δ5的皂甙元。 硫酸-醋酐、硫酸-冰醋酸 主要用于检测甾体皂甙 芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸常用的皂甙类显色剂 对-二甲氨基苯甲醛 主要用于检测三萜皂甙。 实例 复方丹参片中三七总皂甙的测定--大孔吸附树脂分离-比色法

39. (二)薄层色谱法 样品经适当的溶剂提取，用薄层色谱法分离定量。定量方法 可用薄层洗脱-比色法或薄层扫描法。 实例 龟龄集中人参总皂甙的测定--薄层色谱-比色法 归脾丸中远志皂甙元的测定—薄层扫描法

40. 薄层色谱-比色法的一般步骤： 1. 供试品的制备：包括样品的提取与预处理。 2. 对照品溶液的配制 3.薄层板的制备 4.点样 取适量的供试品溶液容定量毛细管或半自动点样器在薄层板距底边1-1.5cm处点样（斑点状或条带状），同时点上对照品的应用溶液作随行对照。对照品与供试品交叉点样。 5.展开：包括预平衡与样品展开、展开方式，展开剂，展距。 6.定位：日光下、紫外灯下观察或碘蒸气定位。 7.斑点捕集 8.洗脱与定量：用合适的溶剂洗脱后加显色剂显色，或加显色剂显色后离心取上清，以相同大小的固定相为空白同法操作，于合适波长处比色定量。

41. 薄层扫描法的一般步骤： 1. 供试品的制备：包括样品的提取与预处理。 2. 对照品溶液的配制 3.薄层板的制备 4.点样 取适量的供试品溶液容定量毛细管或半自动点样器在薄层板距底边1-1.5cm处点样（斑点状或条带状），同时点上对照品的应用溶液作随行对照。对照品与供试品交叉点样。 5.展开：包括预平衡与样品展开、展开方式，展开剂，展距。 6.显色：采用合适的显色剂喷雾显色或衍生化显色，与合适的温度下烤干。 7.扫描定量：在稳定显色的时间内，采用薄层扫描仪选择合适的参数扫描定量。

42. （三）高效液相色谱法 主要用于单体皂甙和皂甙元的含量测定。 具有较强紫外吸收的皂甙类成分可用HPLC法分离测定并用紫外检测器（HPLC-UVD） 无紫外吸收或紫外吸收较弱的皂甙类成分可用HPLC法分离测定并用蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）

43. 第三节 醌类成分的分析 中药中存在的蒽醌衍生物多为羟基蒽醌和它们的甙。 常用的含蒽醌类化合物的中药，首推大黄，此外还有芦荟、决明、茜草、虎杖、何首乌、番泻叶、萱草等。 含有醌类成分的中成药制剂比较多见，以含大黄、何首乌、紫草、丹参的中药制剂为代表。 一、蒽醌类成分的定性分析 (一)化学显色反应 1. Borntrager反应：羟基蒽醌类化合物遇碱显红～紫红色

44. 2.有α-酚羟基或邻二酚羟基结构的蒽醌类化合物可与Mg2+形成橙红、紫红、橙黄、蓝紫等颜色的络合物。生成的产物具有下列结构：2.有α-酚羟基或邻二酚羟基结构的蒽醌类化合物可与Mg2+形成橙红、紫红、橙黄、蓝紫等颜色的络合物。生成的产物具有下列结构：

45. (二)薄层色谱法 薄层色谱法是鉴别含蒽醌类成分的中药制剂的最主要的定性方法。 吸附剂多用硅胶， 展开溶剂系统： a.用于蒽醌类成分的大都是各种溶剂的混合系统，而且大多含有水或甲醇。 b.乙酸乙酯-甲醇-水(100∶16.5∶13．5或相近的配比)是用途最广的展开剂，适于分离蒽醌甙元和蒽醌甙。 c.正丙醇-乙酸乙酯-水(4∶4∶3)和异丙醇-乙酸乙酯-水(9∶9∶4)适于分离番泻甙和二蒽酮甙。 显色方法主要有喷碱性试剂或醋酸镁甲醇液、氨气熏及在紫外灯下观察荧光，亦可在可见光下直接观察色斑。

46. (三)升华法 游离的蒽醌及其他醌类衍生物多具有升华性。中药制剂中如含有这类成分量较大，可采用升华法得到升华物，可见光下观察或加碱性试液显色定性。

47. 二、蒽醌类成分的定量分析 (一)比色法 1.加碱比色法 1）游离蒽醌的测定 称取中药制剂粉末适量，在索氏提取器中用氯仿回流提取至无色。氯仿提取液移入分液漏斗中，以5％氢氧化钠-2％氢氧化铵混合碱液分次提取至无色，合并碱液，用少量氯仿洗涤，氯仿弃去，碱液调整至一定体积，若不澄清，可用垂熔漏斗过滤，滤液在沸水浴中加热4分钟，用冷水冷却至室温，30分钟后在490nm处比色，以1，8-二羟基蒽醌为对照品，计算含量。 2）总蒽醌的测定 称取中药制剂粉末适量，先用盐酸或硫酸水解蒽醌甙。然后用非极性溶剂如氯仿提取甙元后同上法测定。 3）结合蒽醌的测定a. 结合蒽醌=总蒽醌-游离蒽醌 b.极性溶剂提取蒽醌甙，水解成甙元后， 用1）法测定。

48. 2.醋酸镁比色法 1）游离蒽醌的测定 称取中药制剂粉末适量，在索氏提取器中用氯仿回流提取至无色。将氯仿提取液蒸干，残渣加0.5%醋酸镁甲醇液溶解，并定容。在498nm处比色，以1，8-二羟基蒽醌为对照品，计算含量。 2）总蒽醌的测定 称取中药制剂粉末适量，先用盐酸或硫酸水解蒽醌甙。然后用非极性溶剂如氯仿提取甙元后同上法测定。

49. 二)薄层色谱法 薄层色谱法主要用于分离测定单体蒽醌类化合物。 蒽醌类化合物的薄层色谱条件和显色方法可参考定性分析部分。 实例 当归龙荟丸中大黄素的测定 --洗脱定量法 --TLC 扫描法 (三)高效液相色谱法 高效液相色谱法也主要用于分离单体蒽醌类化合物。 实例 黄连上清丸中大黄游离蒽醌甙元的测定 P172-173