1 / 25

Metodika přípravy medií obecně

Metodika přípravy medií obecně. 1/ Příprava zásobních roztoků RR (1mg - 1 mol - 1 ml). makroelementy (10x) - kromě Ca mikroelementy (100x), příp. 2x ředit FeEDTA vitaminy (100-1000x) (2-3 měs 2-4 °C, déle při -20°C). Komerčně dostupné. koncentrace. Váhové jednotky

kordell
Download Presentation

Metodika přípravy medií obecně

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metodika přípravy medií obecně 1/ Příprava zásobních roztoků • RR (1mg - 1mol - 1 ml) makroelementy (10x) - kromě Ca mikroelementy (100x), příp. 2x ředit FeEDTA vitaminy (100-1000x) (2-3 měs 2-4 °C, déle při -20°C) Komerčně dostupné

  2. koncentrace Váhové jednotky • 10-6 = 1mg.l-1 (ppm) Molární koncentrace 1M = MW v g v 1litru roztoku (1mM = v mg/l, 1 M = v g/l)

  3. Převod mM na mg: MW 2,4-D = 221,0 1mM 2,4-D ……221mg/l 1M 2,4-D …….0,221 mg/l mg/l na mM koncentrace v mg/l MW 1 M = 1 mol .l-1

  4. Rozpouštění RR • 2,4-D, IAA - 96%ETOH nebo 1N KOH • CK - 1N KOH nebo HCl • TDZ - DMSO (dimetylsulfoxid)

  5. 2/ odměření jednotlivých zásobních roztoků podle receptury (navážení komerční směsi) • 3/ přidání sacharozy • 4/ rozmíchání • 5/ doplnění vody do 3/5 celk. objemu • 6/ změření a upravení pH na mag. míchačce (1N HCl a 1N KOH) • 7/ přidat rozehřátý agar (rezerva objemu) • 8/ doplnit horkou vodou do celk. objemu • 9/ rozlít do kultivačních nádob • 10/ zakrýt pečlivě víčkem, případně popsat • 11/ sterilizovat v autoklávu

  6. Modifikace - termolabilní substance (nebo Gelrit) • 1-6 stejné, s vyjímkou termolabilních látek • sterilizujeme celé medium v autoklávu (objemová rezerva) v cejchované nádobě; kult. nádoby zvlášť • necháme vychladnout ve flowboxu cca 50°C • mezitím zfiltrujeme termolabilní látky přes filtr 0,2m • přidáme do chladnoucího media (40-50°C) • dobře rozmícháme a doplníme sterilní dest. vodou • rozlijeme do předem vysterilizovaných nádob

  7. Termolabilní substance* pro přesné pokusy všechny vitamíny, aminokyseliny i RR • Fruktóza, maltóza • Ca-pantothenát • gibereliny, IAA, ABA • riboflavin, k.listová • močovina • asparagin, glutamin • adenin sulfát • enzymy • antibiotika

  8. Dotazy?

  9. ? Pokračovat v teorii ?

  10. Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk

  11. stacionární (můstky, buničitá vata, čedičová vata, polyuretanová pěna, membrány apod.) provzdušňovaná • - třepačky • - klinostaty • - míchaná • - probublávaná

  12. Kultivační nádoby • Magenta (Sigma)

  13. VitroVent

  14. Inkubovaná třepačka • Amplituda • otáčky (rpm)

  15. Kultivační láhev s míchadlem • Pro suspenzní kultury • 100-250 rpm • 1-12 litrů (Techne, Sigma)

  16. Roller • Pomalé šetrné otáčení • 5-60 revolution per hour (do 1 rpm) • jen pro buňky, ulpívající na stěnách nádoby

  17. Kromě chemických podmínek – média • Důležité i plynné prostředí (etylén, CO2 , H2O) • Fyzikální podmínky • teplota • světlo

  18. Způsoby regenerace invitro, orgánové kultury – přímá a nepřímá organogeneze Přímá organogeneze - využití: • rychlé namnožení cenných genotypů (podstatné zvýšení množitelského koeficientu, množení těžko množitelných kultur, cenných jedinců, vzácných druhů)

  19. příklady • Brambory klasicky 1: 5 -10 • mikropropagace 1: 500000 • rododendrony apod. • Vzdálená křížení, nedávající plodné potomstvo • šlechtitelsky cenné mutace

  20. Způsoby regenerace invitro, orgánové kultury – přímá a nepřímá organogeneze Nepřímá organogeneze - využití: • selekce (selekční tlak, využití somaklonální variability, mutageneze, transgenoze)

  21. 4/ Způsoby hodnocení a dokumentace kultur • Počet kontaminovaných/ rostoucích/nerostoucích kultur • Měření přírůstku prýtů, kořenů, kalusu • vážení - nárůst hmotnosti • počítání (regenerovaných prýtů, buněk) V různém časovém odstupu

More Related