肿瘤侵袭与转移

1. 肿瘤侵袭与转移 曾 朝 阳 中南大学肿瘤研究所

2. 肿瘤发生的特征

3. 肿瘤侵袭——指癌细胞侵犯和破坏周围正常组织结构，进入脉管系统的过程。肿瘤侵袭——指癌细胞侵犯和破坏周围正常组织结构，进入脉管系统的过程。 肿瘤转移—— 恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道、血管或体腔，到达其他 部位继续生长，形成与原发瘤性质相同的肿瘤的全过程。 瘤细胞侵袭转移的过程是瘤细胞与宿主细胞之间相互作用的连续过程，这个过程是复杂、多步骤的。

4. 肿瘤侵袭-转移的多步骤链 The invasion-metastasis cascade 肿瘤侵袭-转移是一个多步骤和异常复杂的过程，同时也是一个效率很低的过程。其中效率最低的是最后一步——形成微转移灶。

5. 肿瘤细胞从毛细血管中外渗 (A) 一个癌细胞渗入到了毛细血管中 (B) 几分钟之内，血小板聚集在癌细胞周围并形成血栓 (C) 癌细胞与基底膜开始直接接触 (D) 一天之内，血栓被蛋白酶降解掉 (E) 癌细胞在管腔内增殖 (F) 几天之内，癌细胞突破毛细血管基底膜，侵入到附近的软组织。

6. 肿瘤转移 一个非何杰金氏病患者，多处位置发生肿瘤转移。 左边的图片是CT扫描图像与PET扫描图像的重叠。PET主要是检测机体内摄取同位素标记的FDG（氟脱氧葡萄糖）的组织，显示为黄色。肿瘤组织由于代谢旺盛，FDG含量最高。 脑部组织的黄色为正常，腹部的黄色则为肿瘤转移灶。

7. 侵入到淋巴管内的胰腺癌细胞 侵入到淋巴管内的乳腺癌细胞 转移到骨髓中的癌细胞

8. 肿瘤细胞排列成行，向远处转移 右边是转移方向 左边是原发灶 以列队形式由左边向右进行迁移。成队排列是非常实际有效的方式。

9. 肿瘤转移的 “土壤-种子学说” 英国医生Stephen Paget大约在1889年首次提出了肿瘤转移的土壤-种子学说：肿瘤细胞具有向全身转移的能力，但是最终在何种组织中定居下来，主要取决于该处的“土壤”是否适合肿瘤种子发芽。这是第一次提出了肿瘤微环境的概念，具有里程碑的意义。 英国医生Stephen Paget

10. 土壤-种子学说 癌细胞随机向身体各处转移，碰到合适的土壤就定居下来。 决定癌细胞转移方向的主要是转移灶的微环境。 土壤-种子学说的不足 癌细胞通过循环系统向特定组织转移，如结肠癌细胞通过门静脉向肝转移。 多种肿瘤有向肺组织转移的倾向，就是因为肺的毛细血管网络复杂，“陷阱多”。 很少有肿瘤同时发生在双侧的乳腺，肾，肺。

11. 原发肿瘤 常见继发转移器官 肺小细胞癌 骨、脑、肝 结肠、胃癌 肝 睾丸癌 肝 眼脉络膜黑色素瘤 肝 肝癌 肺、骨 乳腺癌 骨、脑、肾上腺 甲状腺癌 骨 前列腺癌 骨 肾癌 骨、肝、甲状腺 膀胱癌 脑 皮肤黑色素瘤 肺、脑 神经母细胞瘤 肝、肾上腺

12. 比较64例原发肿瘤与12例转移灶的基因表达谱差异，寻找转移相关性基因。比较64例原发肿瘤与12例转移灶的基因表达谱差异，寻找转移相关性基因。 以这9个基因的下调和8个基因的上调构成了“肿瘤转移特征” --Sridhar Ramaswamy et al., Nature Genetics 33, 49-54 (2003)

13. 是否具有表达谱上的“转移特征”极大地影响了患者预后是否具有表达谱上的“转移特征”极大地影响了患者预后 利用这个“转移特征”分析四种不同肿瘤的预后，具有较好的区别能力。

14. Angiogenesis（血管新生） 肿瘤微环境对肿瘤细胞生长最大的支持就是血管新生！ 病理学家已经发现肿瘤细胞如果同血管的距离超过0.2毫米，则无法得到足够的营养和氧，将停止生长。 绿色的毛细血管，红色表示缺氧程度（EF5染色）。离毛细血管越远的组织，染红色越深，靠近血管的组织，则未染成红色。 蓝色的血管，红色表示缺氧，绿色表示极度缺氧，橙色表示中度缺氧。N表示坏死。离血管越远的组织，缺氧越严重，甚至发生坏死。

15. 毛细血管(CD31染色） 毛细血管(CD31染色） 离血管近的组织（虚线范围内）形态良好，因为得到了充分的氧供。而超出这一范围的组织，则出现坏死。充分说明血供对肿瘤细胞生长的重要性。

16. 原位癌 侵袭性癌 毛细血管 毛细血管的密度：在侵袭性的肿瘤中远远高于原位癌组织。

17. 胰腺肿瘤发生发展过程中的血管新生 一半胰岛细胞出现增生，但是血管密度仍不变 正常的胰岛细胞，红色的血管 血管密度明显增加 肿瘤形成，血管密度明显增加 鼠模型内胰腺肿瘤发生过程中血管新生的情况。

18. 移植到小鼠体内的人结肠癌细胞，在生长过程中，血管新生非常明显。移植到小鼠体内的人结肠癌细胞，在生长过程中，血管新生非常明显。

19. 正常组织中的血管 肿瘤组织中的血管 绿色的管腔，红色的为周细胞和平滑肌细胞。 在正常组织中，周细胞将血管包裹得非常严实，而在肿瘤组织中，周细胞同血管的接触非常松散。说明肿瘤组织中的毛细血管的结构已经发生变化，利于血管新生和扩散。

20. 正常组织，血管分布紧紧有条 肿瘤组织，血管分布极度紊乱，扭曲 肿瘤组织相关的血管分布以及严重的扭曲和紊乱

21. 实时影像技术显示正常组织的毛细血管网络体系整洁明了，而肿瘤组织的毛细血管网络体系混乱嘈杂。实时影像技术显示正常组织的毛细血管网络体系整洁明了，而肿瘤组织的毛细血管网络体系混乱嘈杂。

22. 肿瘤组织中的毛细血管管壁存在许多孔隙，而正常组织中的血管壁则没有。导致的后果是血管中的流质渗透到肿瘤组织中，增大了该处的压力，给肿瘤化疗带来困难。肿瘤组织中的毛细血管管壁存在许多孔隙，而正常组织中的血管壁则没有。导致的后果是血管中的流质渗透到肿瘤组织中，增大了该处的压力，给肿瘤化疗带来困难。 实质肿瘤中淋巴管消失，其周围的正常组织中存在许多染为红色的淋巴管。淋巴管的消失导致肿瘤组织间隙的液体无法被及时回收，其压力陡增。

23. 血管新生的激活剂和抑制剂 血管新生是血管生长因子和血管生长抑制因子均衡作用的结果

24. 上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition, EMT) • 是一个生理过程，指极化的上皮细胞，它们通常与基底膜细胞存在交互作用，经过多种生物学变化，获得了间质细胞的表型，如较强的迁移和侵袭能力、耐受凋亡信号、产生大量的ECM成分。 • 上皮-间质转换（EMT）完成的特征是上皮细胞-基底膜接触处的基底膜被降解，间质细胞形成，能够从表皮层迁移出去。 • 由于EMT是上皮细胞获得迁移能力的有效方式，在成体中成为了占恶性肿瘤90%以上的上皮细胞癌浸润转移的重要途径。 • EMT在乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等多 种癌的浸润和转移中起着举足轻重的作用

25. Transition表示这个变化是一个可逆的过程，不是恶性转化。EMT的反向过程叫间质-上皮转换 (mesenchymal-epithelial transition，MET)。 上皮癌细胞（橙色）经过EMT变成了间质细胞（红色），穿过基底膜，进入血管，再离开血管，经过MET变回为上皮癌细胞（橙色）。

26. integrin Voulgari A. BBA 1796 (2009)

27. 宫颈鳞癌细胞以“成团”的形式突破基底膜 基底膜 侵入基底膜的鳞癌细胞 炎症细胞浸润

28. 乳腺癌原发灶 脑部转移灶 染色 同一患者的原发灶和两年之后的脑部转移灶，免疫组合染色显示具有惊人的相似性。 这是病理学家鉴定转移灶的来源的主要证据。 也说明转移灶经历了EMT和MET两个过程。 乳腺癌原发灶 脑部转移灶 染色

29. 红色的cytokeratin 18蛋白 绿色的完整的基底膜 结肠癌 原发灶 侵袭面 肝转移灶 在侵袭面中，基底膜消失了 结肠癌原发灶中，基底膜非常完整，cytokeratin 18蛋白大量表达，这是一个经典的上皮细胞的marker. 癌细胞突破基底膜，在侵袭面可以看到基底膜基本消失，cytokeratin 18的表达下降。说明癌细胞正在经历EMT。 在肝转移灶中，癌细胞的基底膜完整，cytokeratin 18的表达正常。说明癌细胞已经回到了上皮细胞状态。

30. 将人乳腺癌细胞种植到裸鼠皮下。 免疫荧光使用的抗体为针对人的特异性抗体，红色和绿色的信号说明这些细胞来自人乳腺癌细胞，而非鼠细胞。 免疫荧光检测可以看到，肿瘤组织中间部位的细胞有很强的cytokeratin表达，但是没有vimentin表达。 而处于侵袭锋面的癌细胞，则高表达vimentin, 不再表达cytokeratin。细胞形态变为梭形，说明正在经历EMT。 上皮细胞的标志 间质细胞的标志 DAPI染核

31. 免疫组化，vimentin是间质细胞的标志物，染成褐色免疫组化，vimentin是间质细胞的标志物，染成褐色 基质 癌组织与基质接触处，vimentin表达很强。 癌组织内部，不与基质接触处，vimentin不表达。 基质结肠是诱导癌组织发生EMT的关键。微环境是控制EMT的关键。

32. 肿瘤微环境促进EMT的模式图 上游信号:胶原，EGF, FGF, HGF, TGFbeta，以及MMP3通过多个途径均可影响EMT。

33. Molecular markers of EMT EMT的启动依赖于几个关键的分子事件： • 特异性的细胞表面分子的表达， • 细胞骨架蛋白的重组， • ECM降解酶的产生， • 特异性的microRNA分子的表达, • 一系列转录因子的激活。 这些事件所涉及到的分子往往也是EMT过程的分子标志物。

34. Iwatsuki M. Cancer Sci 2010

36. EMT TGF-β可以诱导上皮细胞发生EMT。 其中E-cadherin是上皮细胞的标志，vimentin是间质细胞的标志。

37. Cancer Metastasis Rev (2009) 28:335–344 Fig. Regulation of E-cadherin expression. Upstream signals, and in particular TGFβ, increase expression of transcriptional repressors of E-cadherin (Zeb-1, Zeb-2, Twist, Snail,and Slug) that function by binding to two so-called “E-box” elements that are located within the E-cadherin promoter. This results in recruitment of histone deacetylases and possibly histone and DNA methyltransferases to the E-cadherin promoter, resulting in transcriptional silencing. Members of the miR200 family of micro-RNAs directly antagonize this process by binding to multiple copies of specific “seed” sequences located within the mRNAs encoding Zeb-1 and Zeb-2, resulting in transcript degradation and inhibition of translation.

39. A well established in vitro EMT assay ---- TGF- β induced EMT in NMuMG murine mammary epithelial cells. The microRNA (miR)-200 family ------ mmu-miR-200a, -200b, -200c, -141 and -429

40. Down-regulation of miR-200 Family miRNAs during EMT— FIG 1. Overexpression of miR-200 family hinders EMT and up-regulates E-cadherin expression. A, phase contrast images and immunofluorescence staining of E-cadherin and N- cadherin in NMuMG cells undergoing EMT. B, Western blot analysis confirms down-regulation of E-cadherin and up-regulation of N-cadherin during EMT.

41. C, changes in the miR-200 family levels in TGF-treated NMuMG cells, as measured by TaqMan qRT-PCR and normalized to U6 expression. D, upper panel, schematic of chromosomal locations of the miR-200 family members in the mouse genome. Lower panel, sequence alignment of the miR-200 family members. Nucleotides 2–7, representing their seed sequences, are underlined. miR-200 members embedded within cluster 1 are in blue, whereas those embedded in cluster 2 are in red. Chr 4, chromosome 4.

42. Overexpression of miR-200 Members Individually or in Combination Represses EMT and Enhances E-cadherin Expression — E, changes in expression of E-cadherin in NMuMG cells treated with TGFand transfected with miR-200 members individually, as clusters (C1 or C2), or altogether (All), as measured by real-time PCR. Expression levels are compared with cells untreated with TGF (control) or TGF-treated cells transfected with a negative control pre-miR (Neg.). F, phase contrast microscopy and E-cadherin staining of NMuMG cells untreated or treated with TGFafter being transfected with negative control pre-miR, cluster 1, cluster 2, or both clusters simultaneously (Cluster 12). Cell morphology is outlined in yellow.

43. 4TO7--- • a mammary carcinoma cell line derived from a spontaneous mammary tumor in a wild-type BALB/c mouse . • The 4TO7 cell line is highly invasive and is capable of seeding numerous micrometastases from orthotopic mammary gland tumors in BALB/c recipient animals. • Microscopically, the 4TO7 cells display a typical fibroblastic morphology,consistent with a very low level of E-cadherin expression (Fig. 2B) and miR-200 family miRNA expression.

44. Overexpression of the miR-200 Family Reverses the Mesenchymal Characteristics of the 4TO7 Mammary Carcinoma Cell Line-- FIG 2. miR-200 family targets transcriptional repressors ZEB1 and ZEB2 to enhance E-cadherin expression and inhibit migration. A, phase contrast microscopy of 4TO7 cells transfected with negative control pre-miR (Neg.), cluster 1, cluster 2, or both clusters simultaneously (Cluster 12). Cell morphology is outlined in yellow. B, E-cadherin staining of 4TO7 cells transfected with negative control pre-miR or cluster 1.

45. Direct Targeting of E-cadherin Transcriptional Repressors ZEB1 and ZEB2 by miR-200 Family miRNAs — C, schematic of putative miR-200 target sites in the mouse ZEB1 and ZEB2 3-UTRs. White boxes represent target sites for miR-200b/200c/429, whereas black boxes represent target sites for miR-200a/141. D, normalized activity of luciferase reporter with the ZEB1 (brown bars) or ZEB2 (green bars) 3-UTR in 4TO7 (left panel) or HeLa cells (right panel) in the presence of co-transfected negative control pre-miR or miR-200 members individually, as clusters (C1 or C2) or both clusters (C1 C2). Luciferase activity was measured after 24 h. The data are mean S.E. of triplicates and are shown as the ratio of firefly to Renilla luciferase activity.

46. E, expression levels of ZEB1 and ZEB2 in NMuMG cells untreated (Control) or treated with TGF, transfected with negative control pre-miR or miR-200 family members individually, as clusters (C1 or C2), or both clusters (C1 C2).

47. F, changes in expression of E-cadherin (E-Cad), ZEB1, and ZEB2 (normalized to GAPDH without further normalization to the negative control) in 4TO7 cells transfected with negative control pre-miR or with cluster 1, cluster 2, or both clusters.

48. miR-200 Family miRNAs Inhibit Migration of 4TO7 Mammary Tumor Cells— G, migration of 4TO7 cells transfected with negative control pre-miR, cluster 1, cluster 2, or both clusters, toward serum containing media.

49. 肿瘤侵袭与转移的相关分子 一、细胞粘附分子 二、细胞外基质降解酶及其抑制物 三、细胞运动因子(自分泌移动因子, 肝细胞生长因子) 四、肿瘤血管生成因子

50. 一、细胞粘附分子（cell adhesion molecules, CAMs） 一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白。 同型粘附（homotypic）——同种细胞间的粘附 异型粘附（heterotypic）——瘤细胞与宿主细胞，或宿主基质的粘附。