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分子细胞生物学实验

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分子细胞生物学实验

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  1. 分子细胞生物学实验 薛良义教授

  2. 实验一、细胞膜的渗透性 1. 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度 。

  3. 2.实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中,由于红细胞对各种溶质的透性不同,有的溶质可以渗入,有溶质不能渗入,渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压,所以促使水分进入细胞,引起溶血。由于溶质透入速度互不相同,因此溶血时间也不相同

  4. 3.材料 • 鲫鱼血细胞

  5. 4.仪器与药品(试剂) • 50ml小烧杯、10ml移液管、试管(1~10cm)和试管架。 • 0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸胺、0.17mol/L硝酸钠、0.12 mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸钠、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮

  6. 5. 方法与步骤 • 1、鱼(鸡)血细胞悬液 • 取50ml小烧杯一只,加1份鱼(鸡)血和10份0.17 mol/L氯化钠溶液,形成一种不透明的红色液体,此即稀释的鱼(鸡)血。 • 2、低渗溶液 • 取试管一支,加入10ml蒸馏水,再加入1ml稀释的鱼(鸡)血,注意观察溶液颜色的变化,由不透明的红色逐渐澄清,说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血,使光线比较容易透过溶液。 • 3、鱼(鸡)红细胞的渗透性 • (1)取试管一支,加入0.17 mol/L氯化钠溶液10ml,再加入1ml稀释的鱼(鸡)血,轻轻摇动,注意颜色有无变化? 有无溶血现象? 为什么? • (2)取试管一支,加入0.17mol/L氯化铵溶液10ml,再加入1ml稀释羊血,轻轻摇动,注意颜色有无变化? 有无溶血现象? 若发生溶血,记下时间(自加入稀释羊血到溶液变成红色透明澄清所需时间)。 • (3)分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同2。

  7. 6.作业与思考题 将观察到的现象(是否溶血、时间)记录下来,对实验结果进行比较和分析 。

  8. 实验二、细胞活性检测 1. 实验目的 学习和掌握细胞活性检查方法 。

  9. 2.实验原理 • 细胞活性检查是细胞培养的基本技术,它是了解不同药物、生化物质处理等效果的直观简便手段,也是评定细胞冷冻效果的方法之一。在细胞冻存和复苏过程中,由于细胞遭受非生理性的低温打击等,不可避免地对细胞产生影响,引起部分细胞活力下降或死亡,通过细胞活性检查可快速检验细胞冷冻效果,是衡量细胞冻存、复苏效果的一种简便易行的方法。 • 染料排除法是检查细胞活性常用的方法,其原理是:细胞损伤或死亡时,某些染料可穿透变性的细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色。而活细胞能阻止这类染料进入细胞内,因此可以鉴别死细胞与活细胞。常用的染料有台盼蓝、碘一碘化钾、ITTC、伊红Y和苯胺黑等,实验步骤基本相同 。

  10. 3.材料 • 鲫鱼血细胞

  11. 4.仪器与药品(试剂) • 显微镜、恒温箱、镊子、载玻片、盖玻片。 • 0.1%台盼蓝溶液(溶于Hanks液)、CuSO4溶液

  12. 5. 方法与步骤 • 1、制备单细胞悬液,并调整细胞浓度在1×106/mL左右。 • 2、染色:取少量细胞悬液,按l:l量加入0.1%台盼蓝溶液,充分混匀,静置15 min。 • 3、用吸管吸取细胞悬液,用细胞计数实验相同的方法将细胞悬液加到细胞计数板上,用10×物镜观察计数,凡折光性强而不着色者为活细胞,染上蓝色者为死细胞。计数100个以上细胞,计算出活细胞在总细胞中的比例。 • 4、取等量的细胞悬液,其中一份加入CuSO4溶液,放置30min后染色,计算出两份细胞悬液中活细胞各占总细胞中的比例 。

  13. 6.作业与思考题 • 计算以上三种情况下,活细胞在总细胞中的比例,并分析原因。

  14. 实验三、细胞骨架的观察 1. 实验目的 了解细胞骨架的结构特征及其制备技术 。

  15. 2.实验原理 • 细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构,根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持,细胞的生长、运动、分裂、分化,物质运输,能量转换,信息传递,基因表达等起到重要作用。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时,可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提,但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存,经用戊二醛固定,考马斯亮蓝R250染色后,可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构(图3-3),就是细胞骨架。

  16. 3.材料 • 洋葱鳞茎

  17. 4.仪器与药品(试剂) • 普通光学显微镜、50ML烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、檫镜纸 。 • M-缓冲液:50 mmol/L咪唑、50 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgCl2、 1 mmol/L EGTA(乙二醇四乙酸)、 0.1mmol/LEDTA、1mmol/L巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇),调pH至7.2。 • 6 mmol/L (pH6.8)磷酸缓冲液(用NaHCO3调pH),1%Triton X-100(用M-缓冲液配制),0.2%考马斯亮蓝R250(其溶剂为:甲醇46.5ml,冰醋酸7ml,蒸馏水46.5ml), 3%戊二醛(用6 mmol/L磷酸缓冲液配制)。

  18. 5. 方法与步骤 • 1. 撕取洋葱鳞茎内表皮置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中,使其下沉。 • 2. 吸取磷酸缓冲液,用1%Triton X-100处理20-30min. • 3. 吸去Triton X-100,用M-缓冲液洗3次,每次10min. • 4. 3%戊二醛固定0.5-1h. • 5. pH6.8磷酸缓冲液洗3次,每次10min. • 6. 0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30min. • 7. 用蒸馏水洗1-2次,细胞置于载玻片上,加盖玻片,于普通光学显微镜下观察。

  19. 6.作业与思考题 • 1. 绘出植物细胞骨架微丝结构图. • 2. 分析和论述在光学显微镜下观察到的细胞骨架的形态特征

  20. 实验四、动物细胞培养(原代细胞培养和传代细胞培养)实验四、动物细胞培养(原代细胞培养和传代细胞培养) 1. 实验目的 熟悉细胞培养的基本操作方法及整个培养过程中培养液的制备与器皿、无菌室的无菌消毒 。 学习原代培养方法,了解细胞的传代方法及其操作过程,学习观察体外培养细胞的形态及生长状况 。

  21. 2.实验原理 用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法,把组织(或器官)从动物体体中取出,经酶消化处理,使分散成单个细胞,然后在人工条件下培养,使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。由于原代培养的细胞刚从活体组织分离出来,所以在一定程度上能反映生物体内的生活状态。利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的繁殖、遗传、转化、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。原代培养可分为组织块培养法和消化法两种。 • 传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:2以上的比例转移,接种到另一培养瓶的培养。这种培养,第一步也是制备细胞悬液,当细胞生长成致密单层时,它很容易被蛋白水解酶和螯合剂(EDTA)所破坏。因为EDTA对钙、镁离子具亲和力,而这两种离子又是细胞保持紧密结合所必需的因素。所以一般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物,做为消化液。 • 体外培养的各种细胞株或细胞系,它们的传代方法基本相同,而各种细胞所需的营养液却各不相同。

  22. 3.材料 • 鲫鱼 • 致密单层的培养细胞

  23. 4.仪器与药品(试剂) • CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、恒温水浴箱、离心机、解剖镊、眼科镊、蜡盘、血细胞记数板、离心管、培养瓶、纱布、培养皿、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球、试管架等 。 • ⑴ RPMI-1640培养基每100ML培养液中含90% RPMI-1640、10%、小牛血清、双抗(青霉素、链霉素)100单位/ML,用7.4%NaHCO3调PH至6.8-7.0,培养液需过滤灭菌。 • ⑵ D-Hanks液(即为无钙、镁离子的Hanks液)。 • (3) 细胞消化液(0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液)

  24. 5. 方法与步骤 • 原代培养 1、取l 0公分长左右草鱼幼鱼用目来水洗净,在0.01%高锰酸钾液中浸泡3 0分 钟后取出,用自来水冲洗,再用碘酒和7 5%酒精棉球擦洗头部。 2、用剪刀取下吻端组织放入含有Hanks液的培养皿中进入无菌室。 3、取下的组织块先在75%酒请中浸洗10秒,然后在Hanks液中连续漂洗三次,每漂洗一次更换新的Hanks液,漂洗后,放在表面皿中。 4、在表面皿中,用滴管加入少量培养液,用锋利的剪刀将组织块剪成约1立方毫米的小块。 5、用弯头镊子将组织小块移入细胞瓶内,把它排列成行,每小块组织相距约2 mm,随即翻转细胞瓶,使组织块的一面朝上,然后加培养液4 ml。 6、将细胞瓶置于25—28℃恒温中静置2h,然后将瓶轻轻翻转,使组织块浸于培养液中,继续静止培养。 7、24~48h后在显微镜下检查,若见细胞自组织块边缘长出,则继续培养3--5日,再换部分或全部培养液。待多数组织块的生长晕相接时,可进行传代培养。

  25. 5. 方法与步骤 • 传代培养 1. 在酒精灯旁打开瓶塞,倒去瓶中的细胞营养液,然后加入适量的无钙,镁离子的PBS液,轻轻摇动,将溶液倒出。 2. 消化与分装:在上述瓶中加入适量消化液(0.02%EDTA或0.04%EDTA+0.5%胰蛋白酶液各一半)以盖满细胞为宜,置于室温,停留2~3min后,翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔小的空隙),如出现缝隙,即可倒去消化液,如未出现缝隙,则可将瓶翻回,继续进行消化,直到出现缝隙为止(消化时间长短与不同的细胞及生长状态有关)。此时,可倒去消化液,加入新配制的营养液3ml,以终止消化。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液,反复吹打瓶壁上的细胞层,直至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时,可继续轻轻地吹打细胞悬液,以使细胞散开。随之即可补加营养液,细胞传代的比例,不同细胞亦不同,HeLa细胞一般以1:2或1:4进行分装,即一瓶细胞可传为两瓶。若原瓶为5ml营养液,要分装成两瓶,则需补液到10ml。混匀后,可将另一半分装至另一培养瓶中。 3. 培养:分装好的细胞瓶上,做好标志,注明细胞代号、日期。置于培养架上,轻轻摇动。以使细胞均匀分布,以免细胞堆积成团。然后置于37℃培养。 4. 观察:细胞培养24h后,即可进行观察。

  26. 6.作业与思考题 • 1、细胞培养获得成功的关键要素是什么? • 2、简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。

  27. 实验五、鱼类基因组DNA的提取 1. 实验目的 掌握鱼类基因组DNA的提取方法 。

  28. 2.实验原理 • 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤。不同生物、不同组织基因组DNA的提取方法有所差异,但都应考虑以下两个原则:(1)防止和抑制DNase对DNA的降解,尽量减少对溶液中DNA的机械性剪接破坏,保证DNA分子一级结构的完整性;(2)尽可能排除其它分子如RNA、蛋白质、多糖、脂类、酚等的污染。 • 采用蛋白酶K消化细胞核,在除去大部分细胞核蛋白成分后,经脉冲场电泳分离可得到长度达Mb级的大片段DNA,可用于染色体的分离、分析,以及大片段基因组文库的构建等。但该方案成本较昂贵。当DNA长度要求在kb级以下时,常用酚抽提法去除蛋白质成分。在pH 8.0条件下,DNA基本分布于水相中,而变性的蛋白质位于上层水相和下层有机相之间的变性层。苯酚抽提法制备的DNA片段长度上限一般可达50 kb,可用于RFLP和PCR实验等。 • 本实验在介绍用酚抽提法从鱼类肌肉组织提取基因组DNA的同时,介绍用试剂盒从鱼类血液中提取基因组DNA。

  29. 3.材料 • 鲫鱼肌肉组织、血液

  30. 4.仪器与药品(试剂) • 高速台式冷冻离心机、水浴锅、移液枪、冰箱、紫外分光光度计、电泳仪、凝胶图像处理系统、研钵、pH计等。 • 试剂 • (1)饱和酚; • (2)饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1); • (3)氯仿/异戊醇(24:1):取24体积的氯仿加1体积的异戊醇混合均匀,置4℃保存备用; • (4)10%十二烷基硫酸钠(SDS):称取10gSDS,用90ml双蒸水加热完全溶解,定容至100ml; • (5)裂解液: • 100mmol/L EDTA pH8.0 • 10mmoL/L Tris pH8.0 • 1% (w/v) SDS • 高压灭菌后4℃保存备用。 • (6)25mg/ml蛋白酶K:取50mg蛋白酶K,溶解于2ml的去离子水中。 • (7)RNase A母液:将RNase A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5),15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15min,使混有的DNA酶失活。冷却后分装成小份保存于-20℃。 • (8)50×TAE电泳缓冲液: • Tris 242g • Na2EDTA·2H2O 37.2g • 冰醋酸 57.1ml • 加H2O溶解并定容至1L。 • 1×TAE工作液:把50×TAE贮存液用H2O稀释50倍即可。 • (9) 10mg/ml溴化乙锭(EB):在100ml H2O中溶解1g 溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,室温避光保存。 • (10) 1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖,置于三角瓶中,加入100ml的TAE工作液,微波炉中加热至完全溶解,冷却至50℃-60℃加入10mg/ml溴化乙锭5μl,摇匀后倒入制胶槽中,室温下凝固完全后,轻轻拔出插好的梳子。 • (11) DNA Marker • (12) 70%的乙醇:取70ml的无水乙醇加双蒸水定容到100ml,置4℃保存备用。 • (13) 3mol/l乙酸钠:将40.8g NaAC·3H2O溶于80ml水,用3mol/l乙酸调至pH5.2,定容到100ml,高压灭菌,储存于4℃冰箱。

  31. 5. 方法与步骤 • 从肌肉组织提取基因组DNA • 1. 取肌肉组织150mg~200 mg,加入500μl裂解液,加入25mg/ml蛋白酶K 3μl,充分剪碎,55℃消化直至完全溶解; • 2. 稍微冷却后加入10mg/mlRNA酶5µl,37℃消化30min; • 3. 加入等体积的饱和酚,充分混合均匀,于4℃,10000rpm离心10min; • 4. 小心移取上清液于新灭菌的离心管中,再次加入等体积的饱和酚,充分混合均匀,4℃,10000rpm离心10min; • 5. 小心移取上清液于另一新灭菌的离心管中,加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),充分混匀,4℃,10000rpm离心10min; • 6. 小心移取上清液于另一新灭菌的离心管中,加入氯仿/异戊醇(24:1),上下颠倒数次使其充分混合均匀,4℃,10000rpm离心10min; • 7. 小心移取上清液于另一新灭菌的离心管中,加入1/10体积的NaAc(3mol/l)和二倍体积-20℃预冷的无水乙醇,置于-20℃冰箱中沉淀过夜; • 8. 将上一步的离心管从冰箱中取出,4℃,14000rpm离心20min,弃上清液; • 9. 加入适量70%的乙醇,反复洗涤沉淀两次; • 10.将沉淀置于室温下自然挥发,直至无乙醇气味; • 11.加入100 μl无菌双蒸水溶解沉淀,待完全溶解后,置于-20℃下保存备用。 • 12.基因组DNA质量检测:用移液枪准确移取5μl DNA溶液,加入1μl 6×载样缓冲液,充分混匀后加入1%的含EB琼脂糖凝胶点样孔中,于1×TAE缓冲液中4V/cm电泳0.5 h。凝胶图像处理系统观察结果并拍照保存,参照Marker粗略估计提取DNA的长度,并判断其降解及污染情况。 • 13. 基因组DNA的定量:用移液枪移取1μl DNA溶液,稀释100倍,测出A260nm、A280nm以及两者的比值

  32. 5. 方法与步骤 • 从血液中提取基因组DNA 1. 按处理样品数准备1.5ml离心管,并各加入GenTLE Solution I 500μl。注意:GenTLE Solution I有引起烧伤的危险,一旦溅入眼中或触到皮肤上,应立即用大量水冲洗。 2. 把混合均匀的100μl血液,加入到分装好的GenTLE Solution I的离心管中,立即振荡数秒钟(注意:不管处理多少样品,血液加入到GenTLE Solution I中,要立即进行振荡混合,否则有可能降低收量)。 3. 室温放置10分钟以上,然后在室温条件下12,000rpm以上离心5分钟(注意:若离心温度低,会对收量和纯度有影响,请于20℃以上离心。)离心时,请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一,离心管的小耳朵朝外。此时几乎看不到DNA沉淀。 4. 将移液枪枪头小心插到离心管内侧的底部,用移液枪缓缓吸去管中溶液,注意不要吸走沉淀物。因为此时沉淀看不清,紧贴在离心管外侧(带小耳朵)的内壁上,除去溶液时,请一定注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁。 5. 加入1ml的GenTLE Solution Ⅱ。此时GenTLE Solution Ⅱ应沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中。 6. 轻柔地上下颠倒离心管数次(注意:剧烈振荡将影响收量和纯度)。室温12,000rpm以上离心2分钟,用移液枪小心地除去上清液。 7. 向离心管中加入GenTLE Solution Ⅲ 500μl,轻微振荡10秒钟充分混合。 8. 室温12,000rpm以上离心5分钟,把上清溶液移至另一个新的离心管中。 9. 加入等体积(500μl)的异丙醇,上下轻柔颠倒数次,均匀混合。 10. 4℃,12,000rpm离心5分钟,小心除去上清溶液(注意:GenTLE Solution Ⅲ中含有影响酶反应的物质,所以一定要除净上清溶液,但应注意不要吸走沉淀)。 11. 加入1ml的70%乙醇清洗沉淀,4℃,12,000rpm离心5分钟,小心地除去上清溶液。 12. 空气干燥沉淀。注意:因为该方法提取的DNA较大,完整性好,所以请一定不要干燥过度。离心管中看不到有明显的液体或没有乙醇气味后,就可以加入TE进行溶解。如果沉淀已变白,说明干燥过度,此时加入TE,可能沉淀不能完全溶解,DNA的收量可能会受到影响。 13. 根据下一步实验需要,用10~50μl适当的溶液(TE缓冲液或水)溶解沉淀。

  33. 6.作业与思考题 • 1、DNA提取的原理是什么? • 2、分析抽提的基因组DNA纯度,如不纯,请分析原因。 • 3、DNA抽提过程中应注意哪些方面?

  34. 实验六、聚合酶链式反应 扩增DNA片段 1. 实验目的 掌握PCR技术的基本原理和操作,了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响 。

  35. 2.实验原理 • 设计一对寡聚核苷酸引物可与目的DNA分子互补,在DNA聚合酶作用下,通过引物延伸核酸的某一区域而进行的重复双向DNA合成,这一过程称为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。其原理是以单链DNA为模板,4种dNTP为底物,在模板3’端有引物存在的情况下,用耐热的DNA聚合酶进行互补链的延伸。多次重复的变性、退火和延伸循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。由于PCR在分子克隆和DNA分析中具有许多广泛的用途,特别是近年来迅速出现了许多以PCR为基础的新技术,因此,学习并尽快掌握这一门常规技术是十分必要的。 • 影响PCR反应的因素主要在于两个方面:1)引物的合理设计;2)PCR反应体系及反应条件的优化

  36. 3.材料 • 鲫鱼基因组DNA

  37. 4.仪器与药品(试剂) • PCR扩增仪,PCR用薄壁管,移液枪。 • 10×PCR buffer,25 mmol/L MgCl2, dNTPs混合液(每种10mmol/L),引物(每种20μM),Taq DNA聚合酶,25 mmol/L MgCl2,ddH2O。

  38. 5. 方法与步骤 1. 在每个灭菌的0.2 ml小离心管中依次加入各种成分(总体积为25µl): • 10×PCR buffer 2.5μL • dNTPs 0.5μL • 引物1 0.5μL • 引物2 0.5μL • MgCl2 1.5 μL • 模板DNA 1.0 μL • Taq DNA聚合酶 0.5μL(1U) • 加PCR专用水至25μL 2. 把加样的离心管稍离心后,放入PCR扩增仪。扩增条件为: • 94℃预变性3min,30个循环(94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸30s),72℃延伸5 min,4℃保存。 3. PCR扩增结束后,PCR产物进行电泳检测,具体步骤参见实验七,本实验的扩增对象是β-actin基因片段,应为400 bp左右。

  39. 6.作业与思考题 1、PCR技术的基本原理及应用。 2、PCR反应液中有哪些成分,各有什么作用?

  40. 实验七、琼脂糖凝胶电泳 1. 实验目的 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的方法

  41. 2.实验原理 • 电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入琼脂糖凝胶的样品孔中,并置于电场中,由于DNA分子双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此DNA分子就会向阳极移动。当DNA分子长度增加时,来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低,不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率,小的DNA片段比大片段移动速度更快,因而可把不同大小的DNA片段分离开来。DNA与溴化乙啶结合后,在紫外灯下,显示红色的荧光条带,参照分子质量标准参照物,可检测目的DNA的大小。 • 一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2~50 kb范围内的DNA片段 。

  42. 3.材料 • PCR扩增产物,琼脂糖

  43. 4.仪器与药品(试剂) • 移液枪、电泳槽、电泳仪、微波炉、凝胶成像系统等 。 • 5×TBE电泳缓冲液(pH8.3):使用时稀释为0.5×TBE,4℃保存备用。 • 溴化乙啶(EB· )显色液(10mg/ml):在20ml H2O中溶解0.2 g溴化乙啶,混匀后于4 ℃避光保存。 • 上样液(6X):0.25%溴酚蓝,质量浓度为40%蔗糖水溶液。 • DNA Marker

  44. 5. 方法与步骤 1、加50毫升TAE或TBE缓冲液于三角瓶中。 2、称取0.5克琼脂糖,于微波炉中加热至完全融化。 3、冷却至60℃左右。 4、加上溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5 μg/ml,轻轻混匀。 • 注意:溴化乙锭(EB)为剧毒物质,操作请带手套。 5、轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却30min以上。 • 注意:倒胶时动作要轻缓以防产生气泡,万一产生气泡,可用移液枪头赶掉。 6、将胶板放入电泳缓冲液(TAE或TBE)中,轻轻拔去梳子,即可上样电泳。 7、取1μl上样液和5 μl PCR反应产物混匀,缓缓加入凝胶的加样孔中。加样时既要防止碰坏加样孔周围的凝胶,也要防止样品在电泳缓冲液中的扩散。 8、加样后的凝胶板可以进行电泳,一般在80~100V的电压或20mA条件下电泳。当溴酚蓝移动到距凝胶板下沿约1cm处,停止电泳。 9、将凝胶放入凝胶成像系统中进行拍照分析。 。

  45. 6.作业与思考题 DNA在琼脂糖基质中的迁移率取决于哪些因素?