BAKTERIEGENETIK

1. BAKTERIEGENETIK Knud Poulsen Institut for Medicinsk Mikrobiologi og Immunologi kp@microbiology.au.dk

2. GENERELT • Et kromosom (haploid) • Cirkulært (få undtagelser) • Ca. 3.000.000 nukleotider (1 mm) • Al information til hvad bakterien kan lave af enzymer, hvordan den ser ud, hvordan den kan give sygdom osv. ligger gemt i rækkefølgen af baserne A T G og C i genomet

3. Et typisk bakteriegen Promoter(binder RNA polymerasen) DNA transkription RNA translation polypeptid aktivtprotein

4. I bakterier er transkription og translation ikke adskilt (ingen membranstrukturer inde i cellen) RNA polymerase DNA polypeptid tRNA RNA

5. Genomsekvensen af Haemophilus influenzae (1995) 1.830.137 nukleotider 1743 gener for proteiner 736 gener med ukendt funktion I dag kendes genomsekvenserne for alle væsentlige humant- pathogene bakterier

6. DNA sekventering Sanger’s dideoxy metode ”next-generation” sekventering

8. Sanger’s dideoxy metode • DNAet opformeres (klones/PCR) • 2. Sekvensreaktion med dNTP, mærkede ddNTP, DNA polymerase • 3. Gelelektroforese der separer med +/- 1 base

9. Roche 454DNA sekventering Der kan læses ca. 500 baser i hver sekvens Der kan læses op til 1.000.000 sekvenser per kørsel

10. Emulsion Based Clonal Amplification(emPCR) A + PCR Reagents + Emulsion Oil B Micro-reactors Mix PCR Library & capture beads (limited dilution, excess of capture beads) Create “Water-in-oil” emulsion Adapter PCR library DNA products “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Perform emulsion PCR 454 • Generation of millions of clonally amplified sequencing templates on each bead From: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )

11. Load Enzyme Beads Load beads into PicoTiter™Plate 44 μm 454 Depositing DNA Beads into the PicoTiter™Plate Only one bead fits per well PicoTiter™Plate: Fiber-optic slide Size: 75 mm ✕ 75 mm depth: 55 μm, length: 44 μm 1.6-3.2 million wells per plate Adapted from: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )

12. 454 FLX Sequencing Reaction https://www.roche-applied-science.com/servlet/RCConfigureUser?URL=StoreFramesetView&storeId=10357&catalogId=10356&langId=-1&countryId=jp

13. 454 PicoTiterPlate Wells Reagent Flow PhotonsGenerated are Captured by Camera Sequencing By Synthesis Reagent flow and image capture Sequencing Image Created Bases are introduced separately to the PicoTiter Plate, images are captured after each flow (one base). Adapted from: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )

14. 4-mer 3-mer Flow Order Measures the presence or absence of each nucleotide at any given position TACG 2-mer KEY (TCAG) 1-mer 454 Sequencing: BaseCalling • Count the photons generated for each “flow” • Base call using signal thresholds • Delivery of one nucleotide per flow ensures accurate base calling • Linearity in signal to at least homopolymers of length eight (quote from company) • Base call accuracy of approximately 99.4% Adapted from: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )

17. Bakterier kan ”føle” omgivelserne Er der aerobt/anaerobt ? Er der jern tilgængeligt ? Hvilke næringsstoffer er der ? Hvad er temperaturen ? Har jeg kontakt med en værtscelle ? Er jeg intracellulært ? Er jeg alene eller er vi mange? Ekspressionen af en lang række gener (produktionen af proteiner) reguleres meget specifikt efter hvad bakterien ”føler”

18. Regulering af laktose-operonen i E. coli

19. Regulering af tryptofan operonen i E. coli

20. Regulering af tryptofan operonen i E. coli Attenuator site Virker som transcriptions terminator på mRNA fordi strukturen får RNA polymerasen til at falde af

21. MUTATIONER SKABER NYE VERSIONER AF BAKTERIERNE (EVOLUTION) Nogle mutationer giver ændringer i proteiner og dermed ændringer i fænotypen, som kan gøre bakterien mere ”fit” eller mere patogen. Evolutionen hos bakterier er meget hurtigere end hos os (kort generationstid, at de er haploide gør at mutationerne slår fuldt igennem med det samme)

22. EVOLUTION Bakteriearter udvikler sig og der kan opstå særligt patogene (eks. H. influenzae, E. coli) eller resistente (eks. MRSA, Salmonella DT104) undergrupper

23. Forskellige bakteriearter har forskellig grad af overførsel af gener / rekombination mellem bakterierne Mutationer dominerer Rekombination dominerer

24. Populationsgenetik på bakterierformål: At undersøge om der er særligt patogene undergrupper af bakteriearten Hvis ja, så at finde ud af hvad der gør dem mere virulente og dermed bedre at forstå patogenesen ved sygdommen Det kan bruges til bedre behandling og bedre forebyggelse (vaccination, begrænse smittespredning). Begrænse spredning af antibiotika-resistens.

25. Populationsgenetik på bakteriermetoden: 1. Indsamle bakterie-isolater a. tidsmæssigt spredt b. geografisk spredt c. fra både infektioner og fra raske bærere 2. Genotype bakterie-isolaterne (f.eks. sekventere 7 ”husholdningsgener”) 3. Lave et stamtræ ud fra sekvenserne (computerprogram) 4. Relatere undergrupper af populationen til sygdom (er nogle undergrupper mere virulente end andre??)

26. Eksempel: Haemophilus influenzae serotype b De invasive isolater (meningitis/sepsis) ligger i clade 3 = Serotype b Hib vaccinen består af serotype b kapselen Konjugeret til et protein Vaccinen beskytter mod invasive H. influenzae infektioner

28. SEROTYPNING isolat 1 Preparation af f.eks. polysakkarid Antigen/antistof reaktion ??? Reaktion = Samme serotype Isolat 2 Isolat 3 Isolat 4

29. Streptococcus agalactiae (gruppe B streptokokker) Neigbor joining tree based on multi locus enzyme electrophoresis, biochemical characteristics, and sequences of fragments of the infB and sodA genes Host tropism correlates with clustering of the strains

30. Global fylogeni af Helicobacter pylori

31. Hvad definerer en bakterieart? • Bakterierne har et fælles ensartet ”core” genom • De har et basalt ensartet stofskifte og husholdningsenzymerne er meget ens i sekvens • Den variable ”undværlige” del af genomet kan være meget forskellig mellem bakterierne • Dette kan give forskelle i virulensegenskaber

32. Overførsel af DNA mellem bakterier

33. TRANSFORMATION Fremmed ”nøgent” DNA optages af bakterien Dette ”nye” DNA kan evt. integreres ind i genomet ved homolog rekombination og derved erstatte det ”gamle” DNA. Derved kan variation i et gen overføres fra en bakterie til en anden.

34. Konjugation Sexpilus Plasmid 34

35. Bacillus subtilis

36. Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus

37. KONJUGATION Der er fysisk kontakt mellem de to bakterier og DNA fra den ene overføres direkte til den anden. Evnen til at overføre DNA ved konjugation bestemmes af et batteri af gener, der tilsammen gør at det er en ”han” bakterie.

38. BAKTERIOFAGER Virus hos bakterier Kan nogle gange sætte sig inde i bakteriens genom og nedarves som andre gener. Dette kaldes en profag og bakterien kaldes lysogen. En række toxiner laves af fager og det er kun de lysogene stammer af bakterien, der kan forårsage sygdommen.

39. Bakteriofag lambda EM billede E. coli inficeret med λ-fager

40. TRANSDUKTION Bakteriofager (eller rettere proteinkapselen fra disse) kan være bærere af DNA fra en bakterie til en anden, og dette fremmede DNA kan evt. indsættes i genomet ved homolog rekombination Variation i et gen kan således overføres fra en bakterie til en anden

41. mobile/transposable genetiske elementer • Segmenter af DNA, der kan flytte fra en position til en anden i genomet • (de indeholder gener, der koder for enzymer som integrase, transposase, rekombinase osv. der ”klipper” segmentet ud og integrerer det ind et nyt sted) • insertionssekvenser,integrons,transposons, • konjugative transposons • Er ofte med til at overføre patogenese-øer fra en art til en anden (flankerer øen) • VIGTIGT: de bærer meget ofte gener der koder for resistens mod antibiotika

42. Conjugative transposons

43. Science december 2003

44. Sekvenser af ribosomal RNA gener (især 16S rRNA) bruges til identifikation af bakterier og til diversitets studier

45. 16S rRNA 16S rRNA molekylet består af: Konserverede områder der er ens i alle bakterier Variable områder der er karakteristiske for den enkelte art Hypervariable områder der er karakteristiske for det enkelte isolat Derfor kan der designes primere til PCR der dækker alle arter og sekvenserne viser hvilken art det er.

46. Diversitetsstudier baseret på 16S rRNA sekvenser En stor del af bakterierne i vores normalflora kan ikke dyrkes på de sædvanlige substrater. Forekomsten af disse ikke-dyrkbare bakterier kan analyseres ved DNA baserede metoder som f.eks. PCR amplifikation og sekventering af 16S rRNA gener og metagenom analyser

47. You are not alone ! Tarmens microbielle flora: biomasse ca. 1,5 kg no. af arter cirka 1000 Antal celler: bakterier 1014 dine egne celler 1013 Antal gener: bakterielle 3x106 dit eget genom 2x104

49. Bakterierne i tarmen har betydning for vores sundhed

50. ”DNA fingerprinting” af bakterier Bruges til epidemiologiske studier f.eks. til at opspore smittekilder f.eks. Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis Spredning af antibiotika-resistente kloner Metode: Bakteriens genom kløves med et restriktionsenzym DNA fragmenterne separeres ved gel-elektroforese (PFGE) DNA fragmenterne visualiseres ved farvning med EtBr og UV-lys