第五章 微生物的营养和培养基

1. 第五章微生物的营养和培养基

2. 第五章 微生物的营养 Microbial Nutrition 营养：有机体吸取和利用营养物质的过程。 营养物质：微生物为了生存就必须从环境中吸取各种物质以合成细胞物质、提供能量以及在新陈代谢中起调节作用。这些物质就称为营养物质。 第一节 微生物的营养要求 第二节 微生物的营养类型 第三节 微生物吸收营养物质的方式 第四节 培养基

3. 第一节 微生物的营养要求 Nutritional Requirements of Microbial Cells 一、微生物细胞的化学组成 二、微生物的6类营养要素

4. 一、 微生物细胞的化学组成 （一）化学元素(chemical element): 大量元素(macroelement):碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁（其中前六种占细菌细胞干重的97%）。 微量元素(trace element): 锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍 、硼。

5. （二）元素在细胞内存在形式： 主要以水、有机物、无机盐的形式存在于细胞中： 1．有机物：蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素及其降解产物 2．无机物：1)参与有机物组成。 2)单独存在于细胞质内以无机盐的形式存在。 3、水：约占细胞总重70%～90%，以游离水和结合水两种形式存在 游离水：干重法可测得； 结合水：不易蒸发、不冻结、也不能渗透,占水总量的17%—28% 。

6. （三）微生物细胞化学组成含量的变化 此组成可因菌种的种类、菌龄、培养基组成、培养条件、分析方法等而有所不同。 微生物细胞的化学组成

7. 二、微生物的6类营养要素 • 碳源 • 氮源 • 无机盐 • 生长因子 • 水 • 能源

8. （一）、碳源（Carbon source） ◆定义：凡可被用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。 ◆功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生物）。 ◆种类: 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、麸皮、米糠等；饴糖；单糖）,脂类、醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含碳的化合物。

9. 微生物的碳源谱

10. 微生物工业发酵中用做碳源的原料 传统种类：糖类（单糖，饴糖） 淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等） 麸皮、各种米糠等 代粮发酵：纤维素、石油、CO2、H2 异养微生物：必须利用有机碳源的微生物 自养微生物：利用无机碳源作为主要碳源的微生物

11. （二）氮源（Nitrogen source ）： 用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养源。 种类：无机氮：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、氨、N2 有机氮：蛋白质及其降解产物（如胨、肽、氨基酸等）、牛肉膏、鱼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆等 功能： 1）提供合成细胞中含氮物，如蛋白质、核酸，以及含氮代谢物等的原料； 2）少数细菌可以铵盐、硝酸盐等氮源为能源。

12. 微生物的氮源谱

13. 实验室常用的氮源有碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。实验室常用的氮源有碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。 生产上常用的氮源 硝酸盐、铵盐、尿素、氨以及蛋白含量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼份、玉米浆等。

14. （三）无机盐（inorganic salt） 定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式供给。 大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （微生物生长所需浓度在10-3~10-4mol/L） 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （微生物生长所需浓度在10-6~10-8mol/L） 一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。

15. 细胞内一般分子成分(如P，S， Ca，Mg，Fe等) 一般功能 特殊功能 酶的激活剂（Cu2+、Mn2+、Zn2+） 特殊分子结构成分（Co、Mo等） 维持渗透压 生理调节物质 酶的激活剂 pH的稳定 大量 元素 微量 元素 无 机 盐 化能自养菌的能源(S、Fe2+、NH4+、NO2-) 无氧呼吸时的氢受体(NO3-、SO42-) 无机盐的生理功能：

16. （四）生长因子（growth factor）： 定义:是一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。 最早发现的生长因子是维生素， 有些微生物生长还需要其它特殊的成分，例如某些乳酸杆菌生长需要核苷；某些酵母菌和真菌生长需要肌醇；某些肺炎球菌生长需要胆碱等。

17. 根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为：根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为： 1. 野生型(wild type)原养型 不需要生长因子而能在基础培养基上生长的菌株 2. 营养缺陷型(auxotroph) 由于自发或诱发突变等原因从野生型菌株产生的需要提供特定生长素物质才能生长的菌株

18. （五）水（water） 人体：~60% 海蛰：~96% 微生物 几种生物的 游离水含量 霉菌孢子：~39% 细菌芽孢： 孢子 营养体 皮层：~70% 核心：极低 细菌：~80% 酵母：~75% 霉菌：~85% 水的生理功能：生命存在的必要条件 ◆水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。 ◆不同细胞及不同细胞结构中游离水的含量有较大差别：

19. （六）能源 • 定义：为微生物提供最初能量来源的营养物质或辐射能 能源谱： 有机物 化学物质（化能营养型） 无机物 辐射能（光能营养型） 光能自养和光能异养

20. 第二节 微生物的营养类型 根据生长所需要的营养物质的性质（碳源），可将生物分成两种基本的营养类型 异养型生物：以复杂的有机物质作为营养物质 自养型生物：能以简单的无机物质作为营养物质 动物属异养型生物，植物属自养型，微生物大多数属于异养型生物，少数属于自养型生物。 根据生长时能量的来源不同，将生物分成两种类型 化能营养型生物：依靠化合物氧化释放的能量进行生长 光能营养型生物：依靠光能进行生长 动物和大部分微生物属化能营养型生物，植物和少部分微生物属光能营养型生物 按供氢体分 无机营养型生物； 有机营养型生物：

21. 光能自养型微生物 以C02作为唯一碳源或主要碳源，并利用光能，以无机物如硫化氢、硫代硫酸钠或其他无机硫化物作为供氢体将CO2还原成细胞物质，同时产生元素硫 光能 CO2＋H2S [CH2O]+2S+H2O 光合色素 光能自养型微生物 包括蓝细菌（含叶绿素）、红硫细菌和绿硫细菌等少数微生物（含细菌叶绿素），由于含有光合色素，因而能使先能转变成化学能（ATP），供机体直接利用。

22. 光能异养型微生物 以CO2为主要碳源或唯一碳源，以有机物（如异丙醇）作为供氢体，利用光能将CO2还原成细胞物质，红螺菌属中的一些细菌属于此种营养类型。 光能 2(H3C)2CHOH+CO2 2CH3COCH3+[CH2O]+H2O 光合色素 光能异养型细菌在生长时大多数采要外源的生长因子

23. 化能自养型微生物 以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源，以无机物氧化释放的化学能为能源,，利用电子供体如氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等使CO2还原成细胞物质。 这类微生物主要有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌。它们在自然界物质转换过程中起着重要的作用。

24. 化能异养型微生物 • 多数微生物属于化能异养型，其生长所需要能量和碳源通常来自同一种有机物。 • 根据化能异养型微生物利用有机物的特性，又可以将其分为下列两种类型： • 腐生型微生物：利用无生命活性的有机物作为生长的碳源。 • 寄生型微生物：寄生在生活的细胞内，从寄生体内获得生长所需要的营养物质。 • 存在于寄生与腐生之间的中间过渡类型微生物，称为兼性腐生型或兼性寄生型。

25. 第三节 微生物吸收营养物质的方式 • 单 纯 扩散 • 促 进 扩 散 • 主 动 运 输 • 基 团 移 位

26. 1.单纯扩散 (simple diffusion or passive diffusion) 被输送的物质，靠细胞内外浓度为动力，以透析或扩散的形式从高浓度区向低浓度区的扩散。 • 特点： • 非特异性 • 结构不变 • 速率较慢 • 无载体参与 • 不需代谢能：物质不能进行逆浓度运输。 • 可运送的养料有限：限于水、溶于水的气体，及分子量小，脂溶性、极性小的营养物质。

27. 细胞膜外 细胞膜 细胞膜内 单纯扩散模式图

28. 2.促进扩散(facilitated diffusion/transport) 营养物通过与细胞膜上载体蛋白（也称作透过酶permease）的可逆性结合来加快其传递速度 • 特点：在促进扩散过程中 • 营养物质本身在分子结构上也不会发生变化 • 不消耗代谢能量，故不能进行逆浓度运输 • 运输的速率由胞内外该物质的浓度差决定 • 需要细胞膜上的载体蛋白（透过酶）参与 • 被运输的物质与载体蛋白有高度的特异性 • 养料浓度过高时, 与载体蛋白出现饱和效应 • 促进扩散的运输方式多见于真核微生物中，例如通常在厌氧生活的酵母菌中，某些物质的吸收和代谢产物的分泌是通过这种方式完成的。

29. 细胞膜外 细胞膜 细胞膜内 恢复原构象 再循环 结合 构象改变 结合 移位 促进扩散模式图

30. 3.主动运送(Active transport) 在代谢能的推动下，通过膜上特殊载体蛋白逆养料浓度梯度吸收营养物质的过程。主动运送是微生物吸收营养物质的主要方式。 特点： • 需要消耗代谢能 • 可以进行逆浓度运送的运输方式 • 需要载体蛋白参与 • 对被运送的物质有高度的立体专一性 微生物所需要的多数营养物质如氨基酸等都是这种运送方式

31. ADP+Pi ATP 细胞膜外 细胞膜 细胞膜内 恢复原构象 再循环 结合 构象改变 移位 主动运送模式图

32. 4. 基团移位(group translocation) 一种由复杂运输酶系统参与的既需要载体蛋白又需要消耗能量的一种特殊主动运送方式 特点： • 需要消耗代谢能 • 可以进行逆浓度运输的运输方式 • 需要载体蛋白参与 • 对被运输的物质有高度的立体专一性 • 底物在运送过程中发生化学变化与普通的主动运送相比，营养物质在运输的过程中发生了化学变化（糖在运输的过程中发生了磷酸化）

33. 基因移位主要存在于厌氧和兼性厌氧型细菌中，也主要是用于单（或双）糖与糖的衍生物，以及核苷与脂肪散的运送

34. 运 送 机 制 依靠磷酸转移酶系统,即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统。包括3种不同蛋白参与：HPr 、酶1 、酶2 运送步骤: 1.热稳载体蛋白(HPr)的激活 细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。 酶1 PEP+HPr 丙酮酸+P-HPr HPr是一种低分子量的可溶性蛋白，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。

35. 2、糖被磷酸化后运入膜内 膜外环境中的糖先与外膜表面的酶2结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通过酶2的作用将糖-磷酸释放到细胞内。 酶2 P-HPr+糖 糖-P +HPr 酶2是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶2。

36. 四种运输营养物质方式的比较

37. 5.膜泡运输 memberane vesicle transport 主要存在与原生动物中（特别是变形虫）中，通过细胞膜的内陷，将营养物质包围，形成膜泡，而进入细胞内的一种运输方式。 胞吞作用 胞饮作用

38. 第四节 培养基(medium) 定义：人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的混合养料。 特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。 用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品

39. 一、培养基的配制原则 （一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确） （二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调） （三）物理化学条件适宜（条件适宜） （四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约） 最后应灭菌处理

40. （一）培养基组分应适合微生物的营养特点 即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。 不同营养类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。如自养型微生物的培养基由简单的无机物质组成。异养做生物的培养基至少需要含有一种有机物质，有机物的种类需适应所培养菌的特点。 按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同： 细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基 LB (Luria-Bertani) 放线菌： 高氏一号培养基 真菌： 查氏合成培养基 PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌； 麦芽汁

41. （二）营养物的浓度与比例应恰当 ●浓度过高——微生物的生长起抑制作用， 浓度过小——不能满足微生物生长的需要。 ●碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标； 碳源中的碳原子的mol数 氮源中所含的氮原子的mol数 C/N比值= ●速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例 ●各种金属离子间的比例

42. （三）物理化学条件适宜－pH、渗透压、水活度及氧化还原势（三）物理化学条件适宜－pH、渗透压、水活度及氧化还原势 • （1）pH:各类微生物的最适生长pH值各不相同： • 细 菌：7.0~8.0 放线菌：7.5~8.5 • 酵母菌：3.8~6.0 霉 菌：4.0~5.8 • 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： • 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 • 外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液

43. （2）氧化还原电势(redox poyential) • 各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求： • 好氧微生物：+0.3~+0.4V,(在>0.1V以上的环境中均能生长). • 厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长 • 兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵 • 对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度 • 尤其是对厌氧微生物，除排除氧外，还应在培养基中加入还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。

44. （四）根据培养基的应用目的选择原料及其来源（四）根据培养基的应用目的选择原料及其来源 该培养基的应用目的，即： 是培养菌体还是积累代谢产物？ 是实验室种子培养还是大规模发酵？ 代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？ ☆用于培养菌体的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）； ☆用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定的代谢产物； ☆当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉的原料，提倡以粗代精，以废代好。

45. 附：培养基的灭菌 1.高压蒸气灭菌 一般培养基: 1.05 Kg/cm2, 121.3℃, 15-30 min 含糖培养基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 ℃, 15-30 min 2.过滤灭菌、 分别灭菌、 间歇灭菌

46. 附：器皿的灭菌及无菌室的消毒 器皿的灭菌： 干热空气： 160℃， 2 小时 无菌室的消毒： 紫外光 化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）

47. 二、培养基配制的方法 1. 生态模拟 2. 参阅文献 3. 精心设计 4. 试验比较 定性 定量、小 大、实验室 工厂

48. 三、培养基的类型及其应用 • 根据所培养微生物的微生物类群来分 • ①细菌培养基 ②放线菌培养基 ③霉菌培养基 • 根据培养目的来分 • ①种子培养基(seed culture medium)——是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基，特点是营养较丰富，氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件，还有意识地加入发酵培养基的基质。 • ②发酵培养基(fermentation medium)——用于生产预定发酵产物，一般以碳为主要元素，碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时，原料应价廉易得，还应有利于下游的分离提取。

49. 细菌培养基——营养肉汤（nutrient broth)： 牛肉膏 3g； 水 1000ml； 蛋白胨 5g ； pH 7.2~7.4 放线菌培养基——高氏1号： 可溶性淀粉 20g； KNO3 1g; K2HPO4 1g MgSO4 0.5g NaCl 1g; FeSO4•7H2O 0.5g 水 1000ml; pH 7.2~7.4 霉菌培养基——查氏（zapek)培养基： 蔗糖 30g; KCl 0.5g; MgSO4.H2O 0.5g; FeSO4 0.5g 水 1000ml; K2HPO4 1g; NaNO3 3g; pH 6.7 酵母菌培养基——麦芽汁培养基

50. 味精生产菌北京棒状杆菌AS1299的一级种子（用摇床培养）味精生产菌北京棒状杆菌AS1299的一级种子（用摇床培养） 培养基配方： 葡萄糖 3% 玉米浆 2.5~3.5% 尿素 0.3~0.5% K2HPO4 0.1~0.2% MgSO4 0.05% 二级种子（1200升发酵罐）培养基配方：以水解糖3%代替葡萄糖3%，其他成分相同。