1 / 38

Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence : (P. Levillain)

Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence : (P. Levillain). Principes généraux. Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps

kiril
Download Presentation

Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence : (P. Levillain)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence : (P. Levillain)

  2. Principes généraux • Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps • On utilise un anticorps connu qui est dirigé contre un antigène que l’on recherche sur la préparation histologique ou cytologique • Puis on met en évidence la fixation éventuelle de l’anticorps sur la lame par un chromogène (IHC) ou un fluorochrome (IF)

  3. 1 - LES ANTICORPS

  4. Les anticorps primaires(ou spécifiques) • Ce sont les anticorps utilisés pour mettre en évidence la présence de l’antigène recherché • Il en existe deux types : • Les AC polyclonaux • Les AC monoclonaux

  5. ANTICORPS POLYCLONAUX Production d’anticorps par des animaux hyper-immunisés

  6. ANTICORPS MONOCLONAUX Technique des hybridomes

  7. Milieu HAT • Hypoxanthine • Aminoptérine • Thymidine • L’aminoptérine bloque une voie métabolique qui peut être contournée par l’utilisation d’hypoxanthine et de thymidine sauf par les cellules du myélome

  8. Anticorps • Polyclonaux : Inconvénients : spécificité relative et variable selon le lot Avantages : 1) coût généralement moins élevé 2) plusieurs épitopes reconnus => marquage plus intense • Monoclonaux : • - spécificité définie • - cette spécificité peut entraîner une moindre sensibilité en cas d’altération des épitopes

  9. Antigènes masqués par la fixation • Restauration antigénique • Chauffage des coupes histologiques (autocuiseur, bain marie, micro-ondes) • Dans une solution acide ou alcaline selon l’anticorps utilisé

  10. 2 – LA REVELATION DU COMPLEXE ANTIGENE - ANTICORPS Immunofluorescence

  11. Immunofluorescence directe fluorochrome

  12. Immunofluorescence à deux étages fluorochrome

  13. Microscope à fluorescence (épi-illumination)

  14. Différents types de fluororochromes

  15. Fluorochrome Fluorochrome Immunofluorescence : Résumé INDIRECTE DIRECTE Cryocut Sérums utilisés Dépôts des sérums sur lames Incubation en chambre humide

  16. Immuno-histo-chimie et Immuno-cyto-chimie

  17. Anticorps primaire conjugué péroxydase

  18. PAP

  19. Autres techniques de révélation

  20. Streptavidinebiotine

  21. Polymères (type Envision)

  22. Application (méthode streptavidine-biotine) • Prélèvements pour histologie standard + IFD en congélation • Préparation des Coupes En congélation: 3 à 4 microns, +/- fixation acétone, séchage, rinçage En paraffine: lames blanches 4 µm puis déparaffinage manuel bains d’alcool successifs puis démasquage antigénique (auto-cuiseur)

  23. Application (méthode streptavidine-biotine) • Technique de révélation classique « streptavidine-biotine-peroxydase »

  24. Résumé du protocole Anticorps primaire puis AC secondaire biotinylé Déparaffinage Démasquage Crayon hydrophobe Streptavidine-peroxydase Substrat + DAB Hématoxyline Montage des lames

  25. Polymères • Technique EnVision : amplification par molécule « porteuse »

  26. Résumé polymère (Kit EnVision) Étape 1 : Blocage des péroxydases endogènes Étape 2 : Anticorps primaire Étape 5 : Contre coloration à l’hématoxyline Incubation Étape 3 : Polymère marqué à la HRP Étape 4 : Substrat chromogène

  27. Technique du double marquage

  28. Technique de double marquage en microscopie optique On doit utiliser deux enzymes différentes

  29. IM et IHCcomparaisonDifficultés et limites

  30. IF / IHC IMMUNO-FLUORESCENCE : Avantage : faible coût et technique facile et rapide mais - ne permet pas la conservation des lames - peu informative sur la morphologie IMMUNO-HISTOCHIMIE : - permet d’apprécier la morphologie des lésion - permet la conservation des lames

  31. Fixation/Congélation

  32. PB = extra cellulaire

  33. Vascularite

  34. HMB 45Marqueur des mélanosomes (cytoplasmique) Chromogène : fast red

  35. RP et noyaux

  36. Difficultés liées à la technique Fluorescence : - découplage du fluorochrome (bruit de fond) (=> diminution bruit de fond par Bleu Evans) - fluorescence spontanée (f. élastiques, glandes sudorales…) - fixation sur des protéines d’origine sérique (lupus) - fixation par des protéines électronégatives (donc tamponner en pH alcalin, bloquer les sites) - « fading » (conservation au froid et obscurité, lecture rapide, montage en milieu alcalin et glycériné)

  37. Difficultés liées à la technique IHC : - peroxydases endogènes - biotines endogènes - zones de nécrose - absorption passive (histiocytes)

  38. Difficulté non liée à la technique • un antigène peut posséder un ou plusieurs épitopes en commun avec un autre Ag (réactions croisées) • CD 10 (cALLA) et cellules du rein • CD 56 (NCAM) cellules NK et tumeurs neuroendocrines

More Related