speci ln sv teln fluorescen n a konfok ln mikroskopie n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie PowerPoint Presentation
Download Presentation
Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 56

Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie - PowerPoint PPT Presentation


  • 264 Views
  • Uploaded on

Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie. Dozvíte se něco o:. Speciální světelné mikroskopii Zástin a fázový kontrast Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Hoffmanův modulační kontrast Fluorescenční mikroskopie Konfokální mikroskopie.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie' - kibo-lucas


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
dozv te se n co o
Dozvíte se něco o:

Speciální světelné mikroskopii

  • Zástin a fázový kontrast
  • Nomarského diferenciální interferenční

kontrast (DIC)

  • Hoffmanův modulační kontrast
  • Fluorescenční mikroskopie
  • Konfokální mikroskopie

Vyzkoušíte si přípravu preparátů

vzor protokolu

Datum

Mikroskopická technika - Blok 2

Vzor protokolu

Úloha 1 – Autofluorescenceplastidu

Organismus

Zvětšení

Nativní preparát

Krátký komentář……..

Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme.

Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz.

Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem.

Foto

Úloha 2 – Značení mitochondrie

Organismus

Zvětšení

Nativní preparát

Krátký komentář……..

Foto

Úloha 3 – Imunofluorescence

Organismus

Zvětšení

Trvalý preparát

Krátký komentář……..

Foto

Foto

Foto

Foto

typy prepar t
Typy preparátů
  • Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé

- různě, jeví se jako barevné

  • Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou

Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů

- optickými metodami

koehlerovo osv tlen

1

Koehlerovo osvětlení

(ideální nastavení světla v mikroskopu)

2

  • V dráze světelných paprsků v mikroskopu existuje několik rovin, které si jsou vzájemně zaostřené (skrze čočky) - konjugované.
  • Pokud pozorujeme objekt v preparátu, tak k naší sítnici (1) je konjugovaná obrazová rovina objektivu (2), rovina preparátu (3). Aby byl preparát ideálně osvětlen, je potřeba, aby s těmito rovinami byla konjugovaná rovina povrchu zdroje světla (4).
  • Nastavení se provádí posunem kondenzoru nahoru a dolů. Zároveň je potřeba světlo vycentrovat.
  • Při takovém nastavení obraz neovlivňuje vlákno žárovky (nerovnoměrný zdroj světla), ale promítá se do něj povrch zdroje světla, ze kterého vychází rovnoměrné odvětlení. Preparát je tak rovnoměrně osvětlen.

3

Povrch zdroje světla

4

nastaven koehlerova osv tlen
Nastavení Koehlerova osvětlení

1

2

2

1

3

http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=fNTNZ8nWPd4

metody zv en kontrastu
Metody zvýšení kontrastu

Zástin: clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku

metody zv en kontrastu1
Metody zvýšení kontrastu

Fázový kontrast: rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě

slide15

Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC):

zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů

zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem

metody zv en kontrastu2
Metody zvýšení kontrastu

Hoffmanův modulační kontrast (HMC):podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)

slide19

Imunofluorescenční barvení

Giardiaintestinalis

  • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 µl roztoku s protilátkami.
  • Inkubovat ve vlhké komůrce30’
slide20

Luminiscence

Chemiluminiscence

luciferáza – luciferin

Excitace zářením:

fosforescence

fluorescence

slide21

Fluorochromy

Přirozená luminisence

chlorofyl

slide22

Fluorochromy

Přirozená luminisence

chlorofyl

Přímá vazba fluorochromu

DAPI, ethidiumBr, propidium jodid

slide23

Fluorochromy

Přirozená luminisence

chlorofyl

Přímá vazba fluorochromu

DAPI, ethidiumBr, propidium jodid

Nepřímá vazba fluorochromu

pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa fluor 635

slide24

Imunofluorescence

F

F

F

F

F

F

vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.)

vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.)

vazba primární protilátky

slide26

Imunofluorescence

F

F

F

F

F

F

HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA

HA

HA

HA

slide27

Imunofluorescenční barvení

Giardiaintestinalis

  • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 μl roztoku s protilátkami.
  • Inkubovat ve vlhké komůrce30’
slide28

Imunofluorescence

HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA

HA

HA

HA

IscU

(mitochondriální

protein)

α-tubulin

slide29

Fluorochromy

Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu

GFP, RFP, YFP, CFP

slide31

Mitotracker

Naegleriagruberi

  • Do kultury přidat 1 μl mitotrackeru.
  • Inkubovat při pokojové teplotě 30’ i více.
konfok ln mikroskop

Obraz je

rekonstruován

počítačem

Zdrojem světla

je laserový

paprsek

Je snímán jen

obraz ze zaostřené

roviny preparátu

Konfokální mikroskop
vyu it fluorescen n a konfok ln mikroskopie
Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie

imunologie – lokalizace epitopů

FITC, DAPI…

vyu it fluorescen n a konfok ln mikroskopie1
Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie

Imunologie: lokalizace epitopů

FITC, DAPI…

Genomika: exprese a funkce genů

GFP, RFP, YFP, CFP

vyu it fluorescen n a konfok ln mikroskopie2
Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie

Imunologie: lokalizace epitopů

FITC, DAPI…

Genomika: exprese a funkce genů

GFP, RFP, YFP, CFP

Proteomika:

sledování pohybů a

interakcí proteinů in situ

PA-GFP, FRAP,FRET

slide48

Autofluorescence plastidů

Zygnemasp.

Euglenagracilis

  • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s immerzním olejem. Plastidy emitují červené světlo.
slide49

Mitotracker

Naegleriagruberi

  • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s imerzním olejem. Mitotracker emituje červené světlo.
slide50

Imunofluorescenční barvení

Giardiaintestinalis

HA

HA

HA

IscU

(mitochondriální

protein)

α-tubulin

slide51

Imunofluorescenční barvení

Giardiaintestinalis

  • Odkápnout roztok s protilátkami
  • Přidat 750 μl PBS
  • Inkubovat 5’
  • Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2
slide52

Imunofluorescenční barvení

Giardiaintestinalis

  • Odkápnout PBS a přidat 500 μl roztoku se sekundárními protilátkami.
  • Inkubovat ve vlhké komůrce30’
slide53

Imunofluorescence

F

F

F

F

F

F

HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA

HA

HA

HA

IscU

(mitochondriální

protein)

α-tubulin

slide54

Imunofluorescenční barvení

Giardiaintestinalis

  • Odkápnout roztok s protilátkami
  • Přidat 750 μl PBS
  • Inkubovat 5’
  • Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2
slide55

Imunofluorescenční barvení

Giardiaintestinalis

  • Montovat médiem Vectashield s DAPI (barví DNA modře)
  • Zafixovat lakem na nehty
  • Pozorovat 1000x zvětšeno s imerzním olejem.
vzor protokolu1

Datum

Mikroskopická technika - Blok 2

Vzor protokolu

Úloha 1 – Autofluorescenceplastidu

Organismus

Zvětšení

Nativní preparát

Krátký komentář……..

Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme.

Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz.

Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem.

Foto

Úloha 2 – Značení mitochondrie

Organismus

Zvětšení

Nativní preparát

Krátký komentář……..

Foto

Úloha 3 – Imunofluorescence

Organismus

Zvětšení

Trvalý preparát

Krátký komentář……..

Foto

Foto

Foto

Foto