外源基因的表达

1. 外源基因的表达 主讲：李志红

2. 外源基因在宿主细胞中表达 导入宿主细胞 外源基因 重组载体 表达载体 在宿主细胞中 表达出蛋白质 提取蛋白 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。

3. 常见表达系统的类型 大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统 原核生物基因表达系统 酵母表达系统 丝状真菌表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统 植物生物反应器 真核生物基因表达系统

4. 大肠杆菌表达系统 • 优点： • 遗传背景清楚 • 用大肠杆菌进行遗传操作的方法非常完善 • 生长繁殖周期短

5. 一、大肠杆菌表达载体的结构 除了含有与克隆载体相同的元件之外，还必须含有表达载体所需要的其它元件: 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子

6. 5’ TTGACA TATAAT 转录起始位点 17bp 核糖体结合位点 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。 -35 Box 和-10 Box

7. 2. 核糖体结合位点（RBS） Shine-Dalgarno（SD）sequence 翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子 SD 5’—AGGAGGU——AUG—— UCCUCCA 16S rRNA3’ SD序列距离AUG的距离影响翻译

8. 3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子，mRNA转录终止信号。

9. 二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子 为何？ 2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA 3. 必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元件控制外源基因的表达 4. 利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害

10. 三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 1. 细胞质中表达 包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 inclusion body • 包涵体形成的原因主要是蛋白高水平表达的结果。

11. ① 优点 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 ②缺点 回收的蛋白生物活性差。

12. 包涵体的分离和溶解 • 包涵体的分离 • 致密的颗粒 ，低速离心收获 • 包涵体的溶解 • 强的变性剂 • 6 mol/ L 盐酸胍或6～8 mol/L 尿素 • 包涵体蛋白的复性 • 去除过量的变性剂和巯基还原剂,并把还原的蛋白转到氧化的环境中促使二硫键的形成 。

13. 2. 周质中表达 周质（periplasm） 革兰氏阴性菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。

14. 3. 胞外表达 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 　由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果不太理想。 外膜 内膜 细胞质 周间质 染色体 质粒

15. 四、几种类型的原核表达载体 1.非融合型表达载体 表达的外源蛋白质不与其它蛋白质融合在一起。 S-D序列 ATG-外源基因-TAG 优点： 产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点： 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。

16. 2. 融合蛋白表达载体系统 表达出的外源蛋白与质粒载体上的另一蛋白（常为标签蛋白）连接在一起。 (1) 优点 便于分离和纯化。 (2) 组成结构 ①启动子：tac ②操纵基因：lacP ③调节基因：lacI ④S-D序列 ⑤ori：pBR322 ori ⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）

17. lacI tac lacP lac O S-D/ATG GST插入位点 TGA (3) 产物提纯 GST融合蛋白用Glutathione Sepharose 亲和层析柱分离纯化。

18. (4) 产物分离 用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从 GST上切下来。

19. (5)其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6 个组氨酸（6×His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA （或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。

20. 原核表达中的问题 • 缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA • 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化 • 融合蛋白形成包涵体（inclusion body），复性后才有活性 • 很难表达大量的可溶性蛋白

21. 五、实例——利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 1. 胰岛素的结构及其生物合成 2. 人胰岛素的生产方法 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建

22. 1. 胰岛素的结构及其生物合成 N C 信号肽 B 肽 C 肽 A 肽 信号肽酶 C 肽（31） R K R S S R C A 肽（21） S S S S B 肽（30） N 高尔基体内的特异性肽酶 S S N C S S S S N C

23. 2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （1）直接提取法制人胰岛素 　　早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。

24. （2）化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。

25. （3）化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。

26. （4）基因工程法制备人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 优点：上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。

27. 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （1）A链和B链分别表达法 化学合成: A、B链的编码序列

28. 表达产物的后处理路线：

29. 生产技术的评价： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。

30. 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 人胰岛素原表达法

31. 表达产物的后处理路线：

32. 生产技术的评价： 　　二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。 　　目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。

33. 第二节外源基因在真核细胞中的表达 为什么建立真核表达系统？ • 原核表达系统不能对表达的真核蛋白进行正确的折叠和翻译后加工!!!

34. 一、真核生物表达的优越性和必要性 1、真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA 2、具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。

35. 3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。 4、另外，真核生物表达的调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控机制。

36. 二、真核生物表达系统 （一） 酵母表达系统 （二）植物细胞表达系统 （三）昆虫细胞表达系统 （四） 哺乳动物细胞表达系统

37. 外源基因 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。

38. 三、外源基因在真核细胞中的表达方式 • 依表达时间长短 • 瞬时表达 不整合 • 稳定表达 筛选 • 表达方式 • 分泌表达，非分泌表达 • 融合表达，非融合表达

39. 外源基因在真核生物中的表达方式 • 瞬时表达（Transient expression）: • 外源基因不整合到宿主染色体中，不能复制，在细胞中的表达时间较短(2-3天)； • 转染的方法相对简单，耗时较少，适用快速分析。 • 稳定表达（Stable expression）: • 外源基因整合到宿主染色体，可获得稳定表达的细胞株，可复制，并可以稳定传代； • 需要筛选，耗时长，不宜成功。

40. 四、真核表达载体 真核表达载体的功能元件 • 原核DNA序列 • 启动子 • 增强子 • 剪接信号 • 终止信号和加poly(A）信号 • 筛选标记 新霉素抗性基因neor 胸苷激酶基因tk

41. 真核表达载体的种类 • 质粒型载体 • pcDNA系列 Invitrogen公司产品 • pCMV-HA Clontech公司产品 • 病毒型载体 • 逆转录病毒载体 • 腺病毒载体 • 昆虫杆状病毒载体

42. 表位标签 tag 方便蛋白的鉴定和纯化 • GST • FLAG（DYKDDDDK），由8个氨基酸残基组成的多肽，具有亲水性，可置于蛋白的氨基或羧基末端，专门设计用于融合蛋白质的免疫吸附纯化 • HA (influenza hemagglutinin epitope-YPYDVPDYA)，流感血凝素抗原决定簇 • His

43. 五、宿主细胞 • 哺乳动物细胞 癌细胞 • 易于传代培养 • 生长速度快而均一 • 转入外源基因后稳定性好 • 酵母 • 昆虫细胞

44. 常用的哺乳动物细胞种类 • 用于稳定表达的细胞 • NIH3T3, CHO ：鼠 • 293, HeLa， HL－60 ：人 • 用于瞬时表达的细胞 • 293，COS ATCC（American Type Culture Collection）-1925年建立﹐是世界上最大的﹑保存微生物种类和数量最多的机构﹐保存病毒﹑衣原体﹑细菌﹑放线菌﹑酵母菌﹑真菌﹑藻类﹑原生动物等约 29000株 中国典型物种保藏中心（武大）

45. 六、重组子导入宿主细胞的方法 • 磷酸钙介导的转染 • 阳离子脂质体介导的转染 Lipofectamineinvitrogen公司产品 • DEAE-葡聚糖介导的转染 • 电穿孔转染 • 病毒转染 • Gene Gun

46. 磷酸钙沉淀法 将外源DNA与CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的HEPES-磷酸钙溶液中，形成DNA－磷酸钙共沉淀复合物。 然后用吸管将沉淀复合物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，细胞可通过内吞作用将复合物吸收到细胞内。 转化率在10%左右。

47. 脂质体介导的转染 • 脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的小球，DNA包裹在脂质体中，通过融合或吞噬作用被细胞吸收。

48. 基因导入方法: 电穿孔法 (Gene transfer by electroporation)

49. 主要基因工程表达体系比较

50. 五、基因表达产物的检测 • Western Blotting • ELISA • 免疫组化 • 原位杂交 • 免疫沉淀 • 免疫荧光抗体