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第九章　酶　型

第九章　酶　型. [ 目的要求 ] 掌握同工酶产生的遗传学基础，分型方法 ２　熟悉红细胞酶型的亚型 ３　了解同工酶的分类与命名，红细胞同工酶的种类. 法医物证学 —— 个人识别 遗传标记 两次或多次出现的检材 同属一个人 ？ 亲子鉴定 遗传标记 被控父亲 生物学父亲？. DNA 序列多态性 ( 如 mtDNA) DNA 长度多态性 ( 如 STR ). DNA 水平 遗传标记. 遗传标记. 红细胞血型 ( 如 ABO)

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第九章　酶　型

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  1. 第九章　酶　型 [目的要求] • 掌握同工酶产生的遗传学基础，分型方法 ２　熟悉红细胞酶型的亚型 ３　了解同工酶的分类与命名，红细胞同工酶的种类

  2. 法医物证学—— 个人识别 遗传标记 两次或多次出现的检材 同属一个人 ？ 亲子鉴定 遗传标记 被控父亲 生物学父亲？

  3. DNA序列多态性(如 mtDNA) DNA长度多态性(如 STR) DNA水平 遗传标记 遗传标记 红细胞血型(如ABO) 白细胞血型(如H LA) 血小板型 酶型(如 PGM 1 ) 血清型(如 Hp) 其他(如 唾液蛋白） 表达产物水 平遗传标记

  4. 酶：活细胞产生的一类具有生物催化作用 的有机物,它能使化学反应迅速进行， 而本身性质不变。 酶的多样性 ：功能相同，结构多样 例——磷酸葡萄糖变位酶

  5. 一、同工酶的概念。 在人体的血液、组织和各种体液中所存 在的能催化相同的化学反应但蛋白质分子结构不相同的一类酶。 活性中心： 结构相同 非催化部分：结构差异

  6. 催化基团 酶活性中心示意图 多肽链 底物分子 活性中心外的必需基团 活性中心内的必需基团 + 结合基团 – 酶的活性中心

  7. 现已发现有数种同工酶。如6-磷酸葡萄糖 脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸 酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酸、肌酸磷酸 激酶、核糖核酸酶、过氧化酶和胆碱酯酶 等

  8. 二、同工酶的分类及命名 （一）分类  根据同工酶编码基因的特点 1.复基因座位同工酶 2.复等位基因同工酶 3.遗传变异体同工酶：

  9. 1.复基因座位同工酶： 又称遗传独立同工酶，由几个不同基因 座位的基因编码，然后编码产物经过组 装成为完整的酶蛋白分子。 乳酸脱氢酶（LDH）：H4、H3M1、 H2M2、H1M3和M4 磷酸葡萄糖变位酶（PGM） ：PGM1、 PGM2、 PGM3

  10. 磷酸葡萄糖变位酶（PGM）的3个不同肽 链分别由不同座位的基因编码，PGM1定 位于1p22.1；PGM2定位于4p14-q12； PGM3定位于6q12。

  11. 2.复等位基因同工酶： ※由同一基因座位上多个表现为显性基因的等位基因编码产生的同工酶。 ※是法医学上受到特殊重视的同工酶。

  12. 3、遗传变异体同工酶： 单基因座的基因发生突变，形成一些不 同的等位基因。这种突变的等位基因编码产生特异的变异多肽。 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）：已发现了140多种变异体.

  13. 酶的分类 I、E、C（国际酶学委员会）1961年制定： 氧化、转移、水解、裂合、异构、合成 1 2 3 4 5 6 1、氧化还原酶类：脱氢或加氢；加氧或脱氧；电子得失 2、转移酶类：基团以一个化合物转移到另一个化合物 3、水解酶类：水解某类化学键 4、裂合酶类：从双键上去掉基团或将基团加至双键上； 包括“裂”及“合” 5、异构酶类：分子基团重排 6、合成酶类：使二分子缔合

  14. 酶编号:由4个数字组成，分别表示酶的大 类、亚类、 亚亚类和顺序号。酶的大类即 按酶促反应的这6种类型进行区分，编号 分别为1、氧化还原酶；2、转移酶； 3、水 解酶；4、裂解酶；5、异构酶；6、连接酶。 如 PGM：2.7.5.1；

  15. （二）命名 国际生化联合会规定了酶的命名原则，即每 一种酶有一个系统名称和一个习惯名称。 例如：NAD+氧化还原酶（醇脱氢酶）

  16. 多态性同工酶： 是指在同工酶中，那些由遗传所 致，在不同个体之间表现出酶蛋 白一级结构差异，并可根据这种 差异将人群分为若干类型的同工 酶。

  17. 三、同工酶的分型方法（电泳分离、酶谱显示） （一）电泳分离 1、历史 1955年，发现了淀粉凝胶电泳法。 1963年，应用淀粉凝胶电泳法发现了第一种红 细胞多态性酶型：酸性磷酸酶。 70年代， 等电聚焦技术的应用 ，多种酶型亚型 的发现 1972年， 发现了磷酸葡糖变位酶PGM1的亚型 1976年， 也发现了磷酸葡萄糖变位酶PGM1的 亚型

  18. 2、同工酶的分型多采用区带电泳或等电聚焦技术。2、同工酶的分型多采用区带电泳或等电聚焦技术。 区带电泳——利用酶蛋白分子的电荷密 度的差异，不同酶蛋白分子在介质中的迁移率不同，从而形成清晰的区带； 等电聚焦技术——根据酶蛋白分子的等电点不同，在pH梯度介质中，酶蛋白分子聚焦在相应的等电点pH位置上，形成狭窄而清晰的区带。

  19. （二）凝胶介质上酶区带的显现和鉴定酶蛋白分子经电泳分离以后，利用酶特异性的催化活性，使之显色，表现出特征性谱带，可据此作出同工酶型的判断。（二）凝胶介质上酶区带的显现和鉴定酶蛋白分子经电泳分离以后，利用酶特异性的催化活性，使之显色，表现出特征性谱带，可据此作出同工酶型的判断。 酶谱技术：这种电泳和组织化学染色两种方法的联合应用。 酶谱：被分离的酶蛋白所显现的特征性谱带。

  20. 1、直接底物显色法：在酶的作用下，无色的底物被酶的催化反应转变成有色产物。常用于测定水解酶。1、直接底物显色法：在酶的作用下，无色的底物被酶的催化反应转变成有色产物。常用于测定水解酶。 例如： 红细胞酸性磷酸酶 酚酞磷酸盐 磷酸 ＋ 酚酞

  21. 2、荧光染色法：在酶的催化下，非荧光底物生成高度荧光的产物或荧光底物转化成非荧光产物， 前者称为正荧光染色，后者称为负荧光染色。 例如： 酯酶 D 4－甲基伞形酮醋酸盐 羧酸阴离子＋甲基伞形酮 （非荧光物质） （发荧光）

  22. 3、电子转移染料染色法： 酶的作用，使特定底物转化成相应产物， 并使辅酶NAD和NADP还原为NADH和 NADPH，同时提供电子给脱氢反应的 受体染料噻唑蓝（MTT）。在催化剂吩 嗪甲酯硫酸盐（PMS）的存在下，噻唑 蓝（MTT）被还原 成暗紫色的不溶性甲 月替，使酶区带显色。

  23. 四、在物证鉴定中应用的多态性同工酶应具备的条件 １. 酶型多态性程度高，个人识别能力及非父排 除率高。 ２. 酶的催化活性易于测定。 ３. 酶活性高而稳定，不易受干燥和其他理化因 素影响。 ４. 电泳检测操作简便，结果重复性好。 ５. 除血液外，在其他人体组织及细胞中也可检 出相同的型别。

  24. 磷 酸 葡 萄 糖 变 位 酶 (PGM)

  25. 一、生物化学性质与生物学功能 PGM是参与糖代谢的重要酶类 PGM 葡萄糖－1－磷酸盐葡萄糖－6－磷酸盐 葡萄糖－1，6－二磷酸盐

  26. ✓分子量：PGM2：61KD > PGM3：53KD > PGM1:51KD。 ✓热稳定性：PGM1 > PGM2 > PGM3 ✓活性： PGM1：占组织中PGM酶活性的80％，红细胞 中50％ PGM2：在人体组织中，其余的PGM酶活性来自 PGM2。 在红细胞中两者活性相当， 各占红细胞酶活 性的50％。 PGM3：胎盘、精子、白细胞和毛根鞘细胞中 PGM4：主要见于哺乳期妇女的乳汁中

  27. PGM1：复等位基因同工酶，是法医学中 常用的遗传标记。 ➢表型 ➢基因 ➢群体遗传学 ➢分型方法

  28. 二、PGM1表型 PGM1的多态性首先由Spencer等在1964年发现。

  29. 1、PGM1普通型 3种由普通凝胶电泳发现的表型： PGM11-1（a、c带） PGM12-2（b、d带） PGM11-2（a、b、c、d带） 等位基因： PGM1*1、PGM1*2

  30. 2、PGM1的稀有表现型 :稀有的表现型都是由一个普通型等位基因与一个稀有型等位基因（PGM1*3～PGM1*8 ）所形成的杂合子 。

  31. 3、PGM1的亚型 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术可区分10种亚型： PGM11+、PGM11﹣、PGM12﹣、PGM12+ PGM11+2 +、PGM11﹣2﹣ 、PGM11+2﹣ PGM11﹣2+、PGM11+1﹣、PGM12+2﹣ PGM1的10种亚型受控于4个共显性等位基因： PGM1*1+、PGM1*1﹣、PGM1*2+、PGM1*2﹣

  32. 三、PGM1基因： 位于1号染色体上 PGM1等位基因DNA序列的主要区别

  33. 四、群体遗传学 （ 一）普通型 大多数群体以PGM1*1频率最高，最高可达 0.90左右。中国各民族的PGM1*1基因频率在0.59～ 0.83之间，绝大多数民族的PGM1*1频率与亚洲其他 地区、美洲黑人、白人和欧洲多数群体之间无明显差异。

  34. （二）、亚型： ➢PGM1亚型的基因频率在各群体之间多无显 著性差异 ➢PGM1亚型的DP值可达0.60以上，是所有酶型系统中最高的。

  35. 五、PGM1的蛋白多态分型方法 1、检材处理 ➢新鲜血液样品取压积红细胞可制成红细胞溶血液。 ➢血痕常规在检验前用0.05mol/L二硫苏糖醇浸泡处理。 ➢精液样品在分离出精子后加等体积蒸馏水冰冻处理。 ➢精斑样品则可直接用蒸馏水浸泡后加样。 ➢毛发样品取带有毛囊的毛根压扁后用缓冲液浸润加样。 ➢人体组织需制成匀浆后用干净纱线或加样纸提取加样。

  36. 2、PGM1的电泳分型和酶谱显示。 普通型：淀粉凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳。 电子转移染料染色法 亚型：聚丙烯酰胺等电聚焦法 电子转移染料染色法。

  37. PGM1在葡萄糖－1，6－二磷酸盐存在下 可催 化葡萄糖－1－磷酸盐转化为葡萄糖－6－ 磷酸盐。葡萄糖－6－ 磷酸脱氢酶可使葡萄糖－ 6－磷酸盐氧化，同时使辅酶NADP＋ 还原为 NADPH。NADPH在吩嗪甲酯硫酸盐的存在下， 使噻唑蓝还原为深蓝色不溶性的甲月替，使酶 区带显色。

  38. 六、PGM1的DNA-RFLP分型 1、外显子4的nt723 PGM1*1：AGATCC PGM1*2: AGATCT，（限制酶BglⅡ的识别点） 2、外显子8的nt1320 PGM1*＋：TATG PGM1*-: CATG，（限制酶NlaⅢ的识别点） 根据这两个点突变和限制酶识别点的相互关系设计 PCR引物，用两种限制酶，可以获得PGM1亚型的DNA分 型。

  39. 红细胞酸性磷酸酶（EAP）

  40. 一、生物化学性质与生物学功能 酸性磷酸酶又称为磷酸单酯磷酸水解酶或酸性磷酸酯酶，是一组在酸性条件下，催化磷酸单酯水解的酶类，能催化磷酸单酯水解成磷酸和醇。

  41. 可分为3大类： 1、ACP1-红细胞酸性磷酸酶（EAP） 2、ACP2-细胞分泌的酸性磷酸酶，如精液ACP(SAP)、 阴道液ACP(VAP) 3、ACP3-组织细胞溶酶体中的ACP 在这三类同工酶中，红细胞酸性磷酸酶是具有遗 传多态性的同工酶。

  42. 二、EAP表型 6种普通表型： EAP A、EAP B、EAP C、 EAP BA、EAP CA和EAP CB 2号染色体短臂上单一基因座的 3个等位基因： EAP*A、EAP*B、EAP*C 此外，EAP基因座存在稀有等位基因EAP*D、 EAP*E、EAP*F、EAP*G、EAP*R、EAP*Tic-1及EAP*0 等。

  43. EAP的泳动度与酶活性

  44. 三、EAP基因 EAP基因位于人类2p25

  45. EAP等位基因DNA序列的主要区别

  46. 四、群体遗传学 ➢各群体中EAP*B的频率都明显高于EAP*A，其中 以黑人EAP*B的基因频率最高，高达0.9以上，黄 种人EAP*B基因频率介于黑人和白人之间。 ➢ EAP基因频率的分布有明显的种族差异，稀有 基因EAP*C多见于白种人，黄种人及其他人种尚 未检出或极为罕见。在中国群体中一般只能检出 A型、B型和AB型三种常见的表型，其中B型频率 最高，BA型次之，A型最少。

  47. 五、分型方法 1、检材处理 用于EAP分型的检材同样常为红细胞溶解液和血痕 血痕：室温保存，9周内能准确进行分型。 数月内，条件较好的用DTT处理后也能正确分型 绒毛组织：细胞溶解液，其EAP具有高度的酶活性， 并且能代表胎儿的表型，可用于亲子鉴定。

  48. 2、EAP电泳分型和酶显谱反应 电泳：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺等电聚焦法 显谱方法：荧光染色法（4－甲基伞形酮醋酸盐） 直接底物显色法 （酚酞磷酸盐 α-萘酚磷酸盐）

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