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芽胞杆菌的分类学特征及其生防菌株的筛选

芽胞杆菌的分类学特征及其生防菌株的筛选. 答辩人 : 刘贯锋 专 业 : 微生物学 导 师 : 刘波 研究员. 绪论. 1. 芽 胞 杆菌生防 菌株的筛选. 6. 2. 5. 3. 4. 主要内容. 芽 胞 杆菌标准菌株 的引进与 保存. 芽胞杆菌经典分类学特性. 芽胞杆菌 16S rRNA 分类学特性. 芽 胞 杆菌脂肪酸 的 分类 学特性. 结论与展望. 7. 1. 一 、绪 论. 研究背景. 目前细菌分类主要是采用多相分类技术。包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。目前已被广泛应用。

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芽胞杆菌的分类学特征及其生防菌株的筛选

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  1. 芽胞杆菌的分类学特征及其生防菌株的筛选 答辩人: 刘贯锋 专 业: 微生物学 导 师: 刘波 研究员

  2. 绪论 1 芽胞杆菌生防菌株的筛选 6 2 5 3 4 主要内容 芽胞杆菌标准菌株的引进与保存 芽胞杆菌经典分类学特性 芽胞杆菌16S rRNA分类学特性 芽胞杆菌脂肪酸的分类学特性 结论与展望 7 1

  3. 一 、绪 论 • 研究背景 目前细菌分类主要是采用多相分类技术。包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。目前已被广泛应用。 芽孢杆菌菌种形态 1 芽胞杆菌的分类方法 1.1 经典分类(表型特征) • FJAT4604Bacillus subtilis FJAT4508 Bacillus simplex

  4. 一 、绪 论 1.2 分子分类法 • 如G+C mol%、DNA重组试验、DNA-DNA杂交、PCR技术、16S rDNA序列测序等等 1.3化学分类法 • 按照微生物的化学组成成分为指针进行微生物分类研究的学科称为微生物的化学分类学。脂肪酸甲酯(Fatty Acid Methyl Ester，FAME)谱图分析方法是鉴于脂肪酸可作为生物标记物而发展起来的分析技术。

  5. 一 、绪 论 芽孢杆菌 的应用 生物肥料 微生物添加剂 生物防治 生物修复

  6. 一 、绪 论 • 研究内容及意义 经典分类 脂肪酸聚类分析 在系统分类学上的意义 16S rRNA分子分类 芽胞杆菌脂肪酸 组成模式数据库 脂肪酸分类 芽孢杆菌 标准菌株 的引进 与保存 大肠杆菌K88 探索芽胞杆菌的生防特性 青枯菌91 枯萎病镰刀菌370

  7. 二、芽胞杆菌标准菌株的引进与保存 • 材料与方法 • 芽胞杆菌真空冷冻干燥保存方法 芽孢杆菌冻干保存步骤

  8. 二、芽胞杆菌标准菌株的引进与保存 • 芽胞杆菌菌种保存质量检测 表1 复苏芽孢杆菌信息 活菌数量×109 • 保存的芽孢杆菌菌种复活数量

  9. 二、芽胞杆菌标准菌株的引进与保存 • 1 复苏活化的芽胞杆菌形态分析 32 Bt-9408 25 Bt-蜡质芽孢杆菌 543 巨大芽孢杆菌 8758 食苯芽孢杆菌 芽孢杆菌菌种复苏图片

  10. 三、芽胞杆菌的经典分类学特性 1 芽孢杆菌的生化特性鉴定 • 材料与方法 明胶液化反应 淀粉水解 蔗糖发酵 接触酶反应 氧化酶反应 M.R反应 硝酸盐还原反应 V-P反应 吲哚反应 葡萄糖氧化发酵 柠檬酸盐反应 脲酶反应 精氨酸双水解 明胶液化反应

  11. 三、芽胞杆菌的经典分类学特性 • 2 运用经典分类法对芽胞杆菌聚类分析 • 反应状态分为阳性和阴性，阳性形状（+）编码为1，阴性形状（-）编码为0。这些特征不考虑分类意义，再现性不好的在矩阵中不随意删除。菌株编码按先后顺序随机排列，在实验中随时出去污染、非芽胞、死亡的菌株，但尽可能做到多样性分类，也包含同种菌株。 • 本实验测定14个分类性状，用NTsys-2软件进行数值聚类分析。

  12. 三、芽胞杆菌的经典分类学特性 1芽孢杆菌生化鉴定结果分析 表2 芽孢杆菌8765-87675生化特性鉴定

  13. 三、芽胞杆菌的经典分类学特性 2 芽胞杆菌生化鉴定结果分析 • 本实验对37株在NA培养基生长的好氧芽孢杆菌生化鉴定结果表明，依据芽孢杆菌的十四种生化特性作为数值分类形状，大多数芽孢杆菌接触酶反应、氧化酶反应、葡萄糖发酵、淀粉水解等呈阳性。 • 吲哚反应、柠檬酸反应、葡萄糖发酵、柠檬酸反应、硫化氢反应等呈阴性。

  14. 三、芽胞杆菌的经典分类学特性 3 芽孢杆菌菌株的经典分类 芽孢杆菌的经典分类树状图

  15. 三、芽胞杆菌的经典分类学特性 3 芽孢杆菌菌株的经典分类 从图5聚类分析表明所有的芽胞杆菌在65%的水平下分为6大聚类。 • 第一群 5 株菌。芽孢杆菌菌株编号FJAT 8753、FJAT 8756、FJAT8757 • FJAT 8759、FJAT 8763。 • 第二群 3 株菌。芽孢杆菌菌株编号FJAT8765、FJAT8777、FJAT8790。。 • 第三群 2 株菌。芽孢杆菌菌株编号FJAT8779、FJAT8786。 • 第四群 4 株菌。芽孢杆菌菌株编号FJAT8754、FJAT8755、FJAT8758、 • FJAT8764。 • 第五群 13 株菌。芽孢杆菌菌株编号FJAT8760、FJAT8762、FJAT8766、 • FJAT8768、FJAT8772、 FJAT8774、FJAT8776、FJAT8785、 • FJAT8767、 FJAT8781、FJAT8770、FJAT8783、FJAT8788。 • 第六群 3 株菌。芽孢杆菌菌株FJAT8769、FJAT8773、FJAT8782。

  16. 四、芽胞杆菌的16srRNA分子分类学特性 材料与方法 芽孢杆菌16srRNA 系统进化树 RDP 数据库 MEGA4.0 Neighbour joining (NJ) Alignment ClustalX 16srRNA 基于16srRNA的芽胞杆菌系统聚类分析

  17. 四、芽胞杆菌的16srRNA分子分类学特性 1 芽胞杆菌16s rRNA系统发育树的构建 芽胞杆菌的16sRNA系统发育树

  18. 四、芽胞杆菌的16s rRNA分子分类学特性 2 芽胞杆菌16s rRNA系统聚类分析 根据图7 芽胞杆菌16sRNA系统发育树的构建，将芽胞杆菌分为六大聚类。 16S rRNA 序列同源性比较与分析。 • GroupⅠ中蜡状芽胞杆菌（B. cereus），蕈状芽胞杆菌（B. mycoides），苏云金芽胞杆菌（B. thuringiensis）同源率在98％，简单芽胞杆菌（B. simplex）与嗜冷芽胞（B .psychrosa ）B. ccharolyticus 同源率100％，弯曲芽胞杆菌（B. flexus与巨大芽胞杆菌 （B. megaterium ）同源率100％ • GroupⅡ中有枯草芽胞杆菌（B. subtilis）与解纤维芽胞杆菌（B. cellulosilyticu） 同源率100％。

  19. Group Ⅳ包括（B. farraginis）, B. fordii, B. fortis同源率在97％以上。 GroupⅤ包括梭形芽胞杆菌（B. fusiformis ）与球形芽胞杆菌（B. sphaericus同源率100％，巴斯德氏芽胞杆菌（B. pasteurii ）与嗜冷芽胞杆菌（B. psychrophilus ）同源率在97％以上。 GroupⅥ中包括（B. agaradhaerens ）, FJAT10016 （B.clarkii ）同源率100％。中胞芽胞杆菌（B. centrosporus ）与溶硫胺芽胞杆菌（B. thiaminolyticus ）同源率在98％以上。 四、芽胞杆菌的16s rRNA分子分类学特性 2 芽胞杆菌16s rRNA系统聚类分析

  20. 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 材料与方法 细菌鉴定： Sherlock微生物鉴定系统（Sherlock MIS）

  21. 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 方法 • 芽孢杆菌脂肪酸的聚类分析 • 供试菌株：49个芽孢杆菌 • 聚类分析方法：以检测出的20种主要脂肪酸的百分含量为样本， 构建矩阵；数据进行中心化，以欧氏距离为聚类尺度， 用平均法进行系统聚类分析

  22. 经鉴定的部分芽胞杆菌的主要脂肪酸成分及含量： 短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis主要脂肪酸16:1w7c(1.5%)、16:0ISO (30.5%)、18:1w7c(17.8%)； 深褐芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus主要脂肪酸15:0 ANTEIS(48.83%)、17:0 ANTEISO(19.45%)、15:0SO(2.23%)、17:0ISO(6.47%)； 栗褐芽胞杆菌(Bacillus badius主要脂肪酸17:1 ISOW10C (5.22%)、15:0 ISO (14.92%)、15:0 ANTEISO (11.04%)； 蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus) 主要脂肪酸15:0ISO(34.52%)、17:0 ISO(6.95%)、14:0ISO( 4.79%)、15:0ANTEISO( 4.53%)、16:0ISO(4.46%)； 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 1 芽胞杆菌主要脂肪酸组成成分析

  23. 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 1 芽胞杆菌主要脂肪酸组成成分析 • 克劳芽胞杆菌(Bacillus clausii,主要脂肪酸15:0ISO(32.77%) 16:0ISO(17.23%) 15:0ANTEISO(15.65%)、17:0ANTEISO(14.5%). • 坚强芽胞杆菌Bacillus firmus,主要脂肪酸15:0ANTEISO (40.01%)、 15:0 ISO (19.54%)、17:0ANTEISO(3.26%)、16:0 ISO(6.32%)、 17:0ISO( 9.47%)； • 芽胞杆菌脂肪酸组成中均有脂肪酸15:0ISO，脂肪酸 14:00、15:0 ANTEISO、17:0 ANTEISO、17:0 ISO也存在大部分芽胞杆菌中.

  24. 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 2 芽胞杆菌脂肪酸生物标记分布 表 3 供试芽胞杆菌脂肪酸生物标记 注：表3中编号所代表的脂肪酸分别代表，1为脂肪酸10:00，2代表脂肪酸12:00i，3代表脂肪酸13:0ANTEISO，4代表脂肪酸13:0ISO，5代表脂肪酸13:0 ISO3OH，6代表脂肪酸17:1 ISOW10C，7代表脂肪酸14:00，8代表脂肪酸14:0ISO，9代表脂肪酸15:0 ANTEISO，10代表脂肪酸15:0 ISO，11代表脂肪酸16:00，12代表脂肪酸16:0 ISO，13代表脂肪酸16:1 W11C，14代表脂肪酸16:1W7CALCOHOL，15代表脂肪酸17:00，16代表17:0 ANTEISO，17代表17:0 ISO，18代表18:00，19代表18:00，20代表18:1w9C。

  25. 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 2 芽胞杆菌脂肪酸生物标记分布 表 4 供试芽胞杆菌脂肪酸生物标记

  26. 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 芽胞杆菌脂肪酸生物标记聚类分析

  27. 五、芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 3 芽胞杆菌主要脂肪酸聚类分析 • 通过脂肪酸生物标记聚类分析当欧氏距离为22.51时根据脂肪酸聚类图9将芽胞杆菌分为五大类，与16SRNA聚类分组比较，16SRNA聚类分组中蜡状芽胞杆菌（B. cereus），蕈状芽胞杆菌（B. mycoides），苏云金芽胞杆菌（B. thuringiensis）同源率在98％以上，在脂肪酸聚类分组中同属于GroupⅤ。 • 16S rRNA聚类分组中的简单芽胞杆菌（B. simplex）与嗜冷芽胞杆菌（B. psychrosaccharolyticus）同源率100％在脂肪酸聚类分组中同属于GroupⅢ。

  28. 芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌370、大肠杆菌k88、青枯菌91抑制效果芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌370、大肠杆菌k88、青枯菌91抑制效果 测定 抑菌圈法 平板对峙法 六、芽胞杆菌的生防菌株的筛选 材料与方法 划线抑菌法 平板对峙法 64.4﹪ CK 处理 芽孢杆菌对镰刀菌370的抑菌图片 抑菌率（﹪）=（对照菌落半径-处理菌落半径）*100/对照菌落半径

  29. 六、芽胞杆菌的生防菌株的筛选 1 芽胞杆菌对青枯雷尔氏菌91拮抗菌筛选 芽孢杆菌对青枯菌91号的划线抑菌图片

  30. 六、芽胞杆菌的生防菌株的筛选 2芽胞杆菌对青枯雷尔氏菌91和大肠杆菌K88拮抗菌筛选 芽胞杆菌对青枯菌91的抑菌圈图片 芽胞杆菌对大肠杆菌K88的抑菌圈图片

  31. 六、芽胞杆菌的生防菌株的筛选 3芽胞杆菌对香蕉枯萎病镰刀菌370拮抗菌筛选 芽胞杆菌对枯萎病镰刀菌370的抑菌圈图片

  32. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 1 芽胞杆菌对大肠杆菌K88的拮抗菌筛选 表5抗大肠杆菌的菌株信息

  33. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 1芽胞杆菌对大肠杆菌K88的拮抗菌筛选 • 对大肠杆菌K88有拮抗作用的菌株有11株，有较强抑制作用的拮抗菌有缓慢芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）。 • 其次，凝结芽胞杆菌（ Bacillus coagulan），弯曲芽胞杆菌（ Bacillus flexus） ，施氏芽胞杆菌（ Bacillus schlegelii），内生芽胞杆菌（Bacillus endophyticus），也有一定的抑菌效果。

  34. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 1芽胞杆菌对大肠杆菌K88的拮抗菌筛选 芽孢杆菌拮抗菌对大肠杆菌k88抑菌作用

  35. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 2芽胞杆菌对青枯雷尔氏菌91拮抗菌筛选 表6 抗青枯雷尔氏菌的菌株信息

  36. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 2 芽胞杆菌对青枯雷尔氏菌91拮抗菌筛选 • 筛选出对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的芽孢杆菌有11株，其中有较强抑制作用的有深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus），蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides），冷解糖芽孢杆菌（Bacillus psychrosaccharolyticus），史氏芽胞杆菌（Bacillus smithii），球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus），溶淀粉类芽孢杆菌（Paenibacillus amylolyticus），内生芽胞杆菌（Bacillus endophyticus）。蜂房芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）。

  37. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 2 芽胞杆菌对青枯雷尔氏菌91拮抗菌筛选 芽孢杆菌对青枯菌91号的抑菌效果

  38. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 3 芽胞杆菌对香蕉枯萎病病原菌370拮抗菌筛选 表7 抗镰刀枯萎病病原菌的菌株信息

  39. 六、芽胞杆菌生防菌株的筛选 3 芽胞杆菌对香蕉枯萎病病原菌370拮抗菌筛选 • 实验通过平板对峙法对50株芽胞杆菌进行初步筛选，筛选出16株对香蕉枯萎病病原菌尖胞镰刀菌370有拮抗作用，占筛选总量的32％。 • 其中10株芽胞杆菌对香蕉枯萎病病原菌尖胞镰刀菌370的抑制率高于60％，芽胞杆菌FJAT-8769左乳酸芽胞杆菌（Bacillus laevolacticus）对香蕉枯萎病病原菌的抑制率最高，为73.3％。 • 其次是FJAT8763凝结芽胞杆菌（Bacillus coagulan）、FJAT8774巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium ）抑菌率为66.7％。

  40. 七、总结与展望 结论 （1）实验所采用的冷冻干燥保存方法保存的芽胞杆菌，通过菌种的复苏活化检测到的芽胞杆菌活菌数高，纯度高。是一种能较长时间保存菌种的方法。 （2）不同的分类法得到的分类结果不同。微生物的特征多样性，每种分类方法采取不同的的标准，得到的结果就有可能不同。 （3）芽胞杆菌属属内菌种的多相聚类分析，运用基于数值分类法、16S rRNA聚类分析 、细胞脂肪酸生物标记的化学聚类法，对芽胞杆菌的系统分类研究表明，细胞脂肪酸分类 结果与16S rRNA聚类分析结果有一定的一致性。

  41. （4）芽胞杆菌对病原菌有一定的抑制作用，本文运用划线抑菌法、利用抑菌圈法、平板对峙法初步研究芽胞杆菌对大肠杆菌，青枯雷尔氏菌，香蕉枯萎病病原菌的拮抗作用，筛选到对香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用的芽胞杆菌有16株，对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的有11株，对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的有11株。（4）芽胞杆菌对病原菌有一定的抑制作用，本文运用划线抑菌法、利用抑菌圈法、平板对峙法初步研究芽胞杆菌对大肠杆菌，青枯雷尔氏菌，香蕉枯萎病病原菌的拮抗作用，筛选到对香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用的芽胞杆菌有16株，对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的有11株，对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的有11株。 特色 以芽胞杆菌标准菌株作为研究对象，将形态、生理生化、分子(DNA碱基分析、分类方法相结合，研究基于化学(脂肪酸分析)法对芽胞杆菌系统分类探索，根据所得数据进行聚类分析，对芽胞杆菌系统分类进行研究；并研究芽胞杆菌对病原菌的拮抗作用，筛选芽胞杆菌拮抗菌，对芽胞杆菌在生物防治的应用有重要指导意义。 七、总结与展望 结论

  42. 七、总结与展望 展望 • 芽胞杆菌与人类关系极为密切，是越来越引起人们重视和研究的一个重要的微生物类群，其有着很好的应用前景。逐步成为人类社会极秀关注酶微生物类群。采用现代分类乎段(16S rRNA测序、脂肪酸鉴定等多相分类相结合)对芽胞杆菌进行分类研究，以期获得已知芽胞杆菌在一些生产应用或者潜在应用价值的菌株，并对建立相应的芽胞杆菌资源库和数据库有重要的意义。细菌脂肪酸作为化学分类法的依据，在菌种下分类上将具有广阔的应用前景。

  43. 感谢导师刘波研究员三年来对我的精心指导，导师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、一丝不苟的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生重要影响。他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。感谢导师刘波研究员三年来对我的精心指导，导师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、一丝不苟的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生重要影响。他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。 感谢福建省农业科学院农业生物资源研究所朱育菁博士和林营志博士对我的指导。感谢在读博士刘国红在实验过程和论文撰写时给予的帮助。 感谢实验室的各位老师、工作人员和同学们对我的帮助，使我得以顺利完成论文。 感谢我的父母和家人、朋友对我的支持和鼓励。 致 谢

  44. 谢谢各位评委老师!

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