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第五章 基因结构和表达变化 与疾病的关系. 基因结构与表达异常与疾病. 蛋白质是生命的物质基础,人体各种生命现象和生命过程主要是通过蛋白质的生理功能体现。 疾病的本质是由各种原因引起蛋白质的质和量的改变的导致的蛋白质空间结构的紊乱。 蛋白质的质和量的改变从分子生物学角度讲,又是基因结构及表达的改变的结果,故基因结构与表达的改变是疾病发生发展的重要机制。. 第一节 不同基因通过不同机制导致疾病发生. 蛋白质功能紊乱是疾病发生的基因病理机制,但不同的基因通过不同机制引起蛋白质功能紊乱。 基因结构改变 环境因素影响了基因的表达
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第五章 基因结构和表达变化 与疾病的关系
基因结构与表达异常与疾病 • 蛋白质是生命的物质基础,人体各种生命现象和生命过程主要是通过蛋白质的生理功能体现。 • 疾病的本质是由各种原因引起蛋白质的质和量的改变的导致的蛋白质空间结构的紊乱。 • 蛋白质的质和量的改变从分子生物学角度讲,又是基因结构及表达的改变的结果,故基因结构与表达的改变是疾病发生发展的重要机制。
第一节 不同基因通过不同机制导致疾病发生 蛋白质功能紊乱是疾病发生的基因病理机制,但不同的基因通过不同机制引起蛋白质功能紊乱。 基因结构改变 环境因素影响了基因的表达 外源致病基因的进入表达:产生了毒性蛋白;产 生了合成非蛋白毒性物 质的酶。
一、基因结构改变导致蛋白质结构或量变化引起疾病一、基因结构改变导致蛋白质结构或量变化引起疾病 由于体内外各种因素改变了某基因特定的DNA序列碱基组成和排列顺序,导致DNA一级结构发生改变,改变了基因结构即基因突变。其分子机制可以是替换、插入或缺失,因而产生不同的突变类型。
(一) 基因突变的多种类型 • 点突变是单个碱基的改变:转换和颠换 • 缺失是一个或多个核苷酸的丢失 • 插入是一个或多个核苷酸的增加 • 倒位是一段核苷酸序列方向倒转 基因突变还分为配子突变与体细胞突变 动态突变指串联重复序列(拷贝数)随世代的传递而改变。
基因突变的类型 • 点突变:单个碱基的改变 在基因一级结构的某个位点上,一种碱基被另一种碱基取代。 分为: 转换 (transition) 颠换 (transversion)
基因突变的类型 • 缺失(delelation)是一个或多个核苷酸的丢失:在基因一级结构中某个位点上,一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失造成的基因结构改变。 3. 插入(insertion)
基因突变的类型 • 倒位是一段核苷酸序列方向倒转:基因内部的DNA序列重组,使一段DNA序列的方向倒转。 • 配子突变与体细胞突变 • 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变(dynamic mutation)
(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应 • 基因突变引起遗传密码的改变:根据基因突变产生的遗传效应不同分为 a. 同义突变 (consense mutation) b. 错义突变 (missense mutation) c. 无义突变 (nonsense mutation) d. 移码突变(frame-shifting mutation)
同义突变(same sense mutation):密码子发生改变, 但所编码的氨基酸不变。 例如:CUUCUCCUG → 亮氨酸
错义突变(missense mutation) 指DNA分子中碱基的取代,经转录产生的mRNA后,相应密码子发生改变,编码另一种氨基酸,使蛋白质中的氨基酸组成和排列顺序发生改变。
无义突变: 由于碱基的取代、缺失或插入,使原来编码某种氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变(nonsense mutation) 。 • 酪氨酸的密码子是UAC,置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便到此停止。 • 亮氨酸的密码子UUA,中间的U变为A这样一个碱基变化就会成为(终止密码子)UAA。
移码突变(frame-shift mutation) • 指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基(但不是三联体密码子及其倍数),在读码时,由于原来的密码子移位,导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。移码突变造成的肽链延长或缩短,取决于移码终止密码子推后或提前出现。
(2) 基因突变影响 hnRNA 的剪接 基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上,导致 hnRNA 的剪接错误,产生异常的 mRNA,最终产生异常的蛋白表达产物,改变生物性状。
(三) 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病 1. 血红蛋白病 (hemoglobinopathy): • 血红蛋白(hemoglobin, Hb)的结构特点 • 珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达
血红蛋白结构 • 血红蛋白是由4条肽链(两个α和两个β链)组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链,都结合一个血红素。 • 血红蛋白的脱氧(T)和氧合(R)构象在氧的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关,所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。
血红蛋白分子一级结构上的轻微差别就可能导致功能上的很大不同,正常成年人血红蛋白中的β链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。
血红蛋白病类型 异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异,导致贫血。 地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少,又称珠蛋白合成障碍性贫血。
四、基因调控序列变异导致表达水平变化引起疾病四、基因调控序列变异导致表达水平变化引起疾病 • 通过对β珠蛋白基因的转录调控序列研究,发现这些调控序列如发生基因突变,就会降低β珠蛋白基因的转录水平, β珠蛋白合成减少,引起β型地中海性贫血。 • 除了调控序列改变会影响相应基因的表达外,基因内的内含子变异也会影响蛋白质合成。
二、细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病二、细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病 人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系,调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。通过细胞间信号传递,能保证基因表达的时间特异性和空间特异性以及表达水平正常。 • AFP 是胚胎发育过程中表达的蛋白,具有免疫抑制作用,保护胎儿免受母体免疫攻击。在接受异常的细胞增殖信号作用下,其基因表达,导致肝癌细胞逃避机体免疫监视。成为肝癌发生的重要因素。
三、细胞内因素导致基因表达异常引起疾病 • 异常的细胞内信号导致基因表达异常引起疾病 高血糖 → DAG↑ → ⊕PKC → ⊕ ACE → AngⅡ ↑ 刺激蛋白质合成 心肌肥大 • 异常的DNA甲基化导致基因表达异常引起疾病 • hCG5‘转录起始区低甲基化→非滋养层细胞hCG ↑ →受体结合→ ⊕cAMP信号途径 →调节其它生长因子产生,促进Tumor形成 ↑
四、病原生物基因的体内表达 1、外原病原生物进入人体内,大量繁殖,生长,引起机械或生物学损伤 2、与人体争夺营养,引起疾病 3、产生生物毒素作用人体,引起疾病 4、外源基因的整合到人基因组上,引变了一些基因结构或表达。
二、基因结构和表达与疾病的研究策略 1.通过结构分析确定基因变异 核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、 化学切割错配、酶促切割错配 2.基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析 3.通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、 反义技术、基因诱导超表达
核糖核酸酶切分析 基本原理: 在一定条件下,异源双链核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割,通过凝胶电泳分析酶切片段的大小,即可确定错配的位置。
核糖核酸酶切分析(RNase cleavage) 缺点: • 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时,核糖核酸酶切割效率低甚至不切割; • 分析DNA的一条链,突变检出率为 30%;同时分析DNA的两条链,突变检出率为 70%; • 需要制备特异性的RNA探针
杂合双链分析法 (heteroduplex analgsis, HA) 直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。 检测缺失突变只适于200-300bp长度片段,且不能确定位置,检出率只有80%.
化学切割错配法 (Chemical cleavage of mismatch, CCM) 基本原理: 将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交,在异源杂合的双链核酸分子中,错配的C能被羟胺和哌啶切割,错配的T能被四氧化锇切割,经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。
化学切割错配法 特点: • 突变检出率高; • 如使用荧光检测系统,灵敏度较高; • 可检测长度达 2Kb的核酸片段; • 步骤多、费时、有毒; • 如对正义链与反义链都进行分析,检测率达100%.
酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage ) • 酶促切割错配是一种与Rnase酶切分析相类似的方法. • 不同之处是该方法采用的酶是T4核酸内切酶Ⅶ能够识别12种错配的碱基,并在错配碱基附近进行酶切. 优点: 对检测DNA片段可用DNA探针杂交检测. 最长检测长度达到1.5Kb. 缺点: 可出现非特异性切割,对错配认别也不是100%.
二、通过基因表达水平分析确定基因在疾病发生中作用二、通过基因表达水平分析确定基因在疾病发生中作用 • 人类疾病发生的另一个重要原因是基因表达水平的改变,因基因表达水平的改变涉及的往往不是单一基因,而是多基因,即一些基因表达增加,一些基因表达降低,导致由其编码蛋白组成的代谢及调节系统异常,引发疾病。 • 因此通过基因水平找到正常与疾病状态下的差异表达基因,确定其在疾病中作用。 • 方法:Northern杂交法,消减杂交技术、差异显示法、定量RT-PCR、基因表达芯片等.
差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR) 在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的,这就是基因的差别表达(differential expression)。
原理:利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。原理:利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。 3’端引物:利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道,poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合:
根据这12种排列组合,设计12种不同的引物,这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成,用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示,M为A、G、C的任一种,N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。根据这12种排列组合,设计12种不同的引物,这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成,用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示,M为A、G、C的任一种,N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。 5’端引物:5’端为10个碱基(10-mer)组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交,杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。 用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增,可获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带,应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5’随机引物。
抑制性差减杂交 (SSH) --- Diatchenko L, et al. PNAS1996; 93:6025-6030 • Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries
抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH) • 原理 SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理,丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA,使不同丰度的单链DNA得到均衡;抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点,使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对,选择性地抑制了非目的基因片段的扩增,从而使目的基因得到富集、分离。
方法 • 提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA,经识别 4 碱基的限制性内切酶切割 • 实验组cDNA平均分为2份,分别连接2个接头 • 进行2轮差减杂交和抑制性PCR • 获得富集的目的基因
抑制性 差减杂交 (SSH) 流程图
抑制性差减杂交(SSH) 检测组 (Tester) — 含目的基因cDNA,加接头 驱逐组 (Driver) — 不含目的基因cDNA,不加接头 * 接头含PCR 引物 正向SSH:易感者(Tester) +不易感者(Driver) 易感者特异表达或高表达基因 反向SSH:不易感者(Tester) +易感者(Driver) 不易感者特异表达或高表达基因
抑制性差减杂交(SSH) • 优点 采用两次差减杂交和PCR,保证了高特异性 (假阳性率可降至6%); 在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化,获得低丰度差异表达基因;操作相对简便,是目前分离新基因的主要方法 • 缺点起始材料需要 g 级量mRNA; SSH差减克隆片段较小,获取cDNA全长序列有一定难度
Elkeles A,et al. Mol Cell Biol 1999; 19: 2594-2600 The c-fos proto-oncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressor 采用SSH法证实, 在p53介导的细胞凋亡过程中,c-fos是p53转录刺激的靶基因,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据 抑制性差减杂交(SSH)
Kostic C and Shaw PH. Oncogene2000; 19:3978-3987 Isolation and characterization of sixteen novel p53 response genes 通过SSH比较了p53缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表达,发现16个p53依赖的下游靶基因 抑制性差减杂交(SSH)
基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理: 分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签(约9-14个碱基对),这些短的序列被连接、克隆和测序,特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。
实验步骤较长要求较高 反转录 酶切 连接 测序 单条测序==对30-40条EST测序 分析 由于采样量大大提高,可对低表达基因进行分析: 基因表达量分析、寻找新基因等等 Serial analysis of gene expression (SAGE) 技术流程
转基因技术 指在生物基因组中带有插入或整合入的外源基因,生物个体能将它一传给后代,并表达出该基因的生物活性物质,从而使受体生物获得新的性状。