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血清 CK 及其同工酶测定 检验系生化

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Presentation Transcript

  1. 血清CK及其同工酶测定检验系生化

  2. 一、概述 • 肌酸激酶(Creatine kinase,CK,EC2.7.3.2)全称腺苷三磷酸:肌酸N-磷酸转移酶,催化肌酸(Cr)和ATP或磷酸肌酸(CrP)和ADP之间磷酸转移的可逆反应。 肌酸+ATP 磷酸肌酸+ADP+H+ CK

  3. 偏碱pH有利于顺向反应进行,中性pH倾向逆向反应,一般逆向反应较顺向反应快2~6倍;偏碱pH有利于顺向反应进行,中性pH倾向逆向反应,一般逆向反应较顺向反应快2~6倍; • Mg2+是CK 的必需激活剂,但过量反而抑制; • 样品宜用血清或肝素化血浆; • 标本应避免严重溶血; • 血清中CK较不稳定,室温4h或4℃12h可使酶失活。

  4. 二、CK测定方法 • 比色法 • 紫外分光光度法 • 荧光法

  5. 比色法 • 利用顺向反应 1、测磷法 CrP在酸液中易水解成Cr及无机磷酸。(ATP与ADP在酸性条件下较稳定)

  6. 2、酶偶联-丙酮酸测定法 肌酸+ATP 磷酸肌酸+ADP ADP+磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸+ATP 丙酮酸+2,4-二硝基苯肼 丙酮酸-2,4-二硝 基苯腙 CK 丙酮酸激酶

  7. ☆顺向反应测定CK的底物较便宜;☆测磷法的试剂较易得而稳定;☆丙酮酸激酶价格较贵,不易获得;☆顺向反应速度较慢,灵敏度较低。☆顺向反应测定CK的底物较便宜;☆测磷法的试剂较易得而稳定;☆丙酮酸激酶价格较贵,不易获得;☆顺向反应速度较慢,灵敏度较低。

  8. CK • 利用逆向反应 CrP+ADP Cr+ATP Cr+双乙酰+α-萘酚 红色化合物 • Mg2+作激活剂; • 半胱氨酸供给巯基; • 氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并终止反应。

  9. 逆向反应的速度较快,敏感性较高,成为目前国内推荐的主要方法。逆向反应的速度较快,敏感性较高,成为目前国内推荐的主要方法。 • 必须用中性或偏碱的蛋白沉淀剂以防止底物CrP在酸性蛋白沉淀剂中非酶性水解成Cr。

  10. 紫外分光光度法 • 多利用逆向反应,是国际最常用方法 CrP+ADP Cr+ATP ATP+Glu ADP+6-P-Glu 6-P-Glu+NADP+ 6-P-GA+NADPH+H+ CK 己糖激酶 G-6-PD

  11. 全部反应最适pH为6.8~6.9; • 主要干扰因素 ①谷光甘肽还原酶 ②腺苷酸激酶

  12. 荧光法 • 利用逆向反应生成的Cr在强碱性溶液中与茚三酮反应产生荧光复合物,测其荧光强度,经与同样处理的Cr标准管比较,可计算CK活力。 优点:快速、敏感,巯基化合物不产生干 扰,试剂易得,操作条件易于掌握。 缺点:需精密荧光分光光度计,不适宜基 层单位使用。

  13. 酶偶联-丙酮酸测定法步骤(顺向反应)

  14. 计算:Au/As×200U/L

  15. 三、血清CK同工酶测定 • 方法:琼脂糖凝胶电泳法。