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生化技术实验 --- 实验十一

生化技术实验 --- 实验十一. 《 生化技术实验 》. 实验 十 离子交换柱层析法分离氨基酸 实验室 112 ，指导老师：吴元喜 E-mail:wuyuanxi@hust.edu.cn Tel: 62253310. 实验 十 离子交换柱层析法分离氨基酸. 一、实验 目的和要求 二、离子交换柱层析的 基本原理 三、实验 器材与试剂 四、离子交换柱层析的 操作技术 五、实验 结果与讨论 六、 思考题. 一、实验 目的和要求. 1 、 了解离子交换层析法分离氨基酸的基本原理 2 、掌握阳离子交换树脂柱层析分离氨基酸的操作方法

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生化技术实验 --- 实验十一

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  1. 生化技术实验---实验十一 《生化技术实验》 实验 十 离子交换柱层析法分离氨基酸 实验室112，指导老师：吴元喜 E-mail:wuyuanxi@hust.edu.cn Tel: 62253310

  2. 实验 十 离子交换柱层析法分离氨基酸 一、实验目的和要求 二、离子交换柱层析的基本原理 三、实验器材与试剂 四、离子交换柱层析的操作技术 五、实验结果与讨论 六、思考题

  3. 一、实验目的和要求 1、 了解离子交换层析法分离氨基酸的基本原理 2、掌握阳离子交换树脂柱层析分离氨基酸的操作方法 3、本实验采用苯乙烯磺酸钠型树脂分离天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸

  4. 二、离子交换层析法的基本原理 1、离子交换剂的组成结构及其的特性 2、柱层析离子交换方式 3、离子交换剂的选择性

  5. 1、离子交换剂的组成结构及其特性 • 离子交换剂的组成单元 • 聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备 • 离子交换树脂的形状结构示意图

  6. 离子交换剂的组成单元

  7. 聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备

  8. 聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂 聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂产品

  9. 离子交换树脂的形状结构示意图

  10. 2、柱层析离子交换方式 • 离子交换的基本过程 离子交换树脂的转型（示意图） 离子交换树脂分离氨基酸（示意图） • 离子动态交换过程（动画）

  11. 离子交换树脂的转型（示意图）

  12. 离子交换树脂分离氨基酸（示意图）

  13. 柱层析离子动态交换过程（动画） 动画按钮

  14. 3、离子交换剂的选择性 （1）平衡常数 （2）选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系 （3）离子浓度对选择性的影响 --平衡的移动遵循质量作用定律 （4）两性物质（氨基酸、蛋白质）的选择性

  15. （1）常数 若KBA值＞1，即[RB]＞[RA]， 离子交换剂对B+的结合力要比对A+的大； 若KBA值＝1，即[RB]＝[RA]， 离子交换剂对B+和A+的结合力相同； 若KBA值＜1，即[RB]＜[RA]， 离子交换剂对B+的结合力要比对A+的小。 KBA值反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性，称KBA值选择系数

  16. 一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F -＜Cl-＜Br-＜I- 不同价阳离子：Na1+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+ （2）选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系 离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。

  17. （3）磺酸基树脂和季胺基树脂对各种离子的相对选择系数（3）磺酸基树脂和季胺基树脂对各种离子的相对选择系数

  18. （4）两性物质（氨基酸 ）的选择性 各种氨基酸分子的结构不同，在同一pH时与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。

  19. 4、离子交换树脂的交换容量 交换容量: 离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。 (mg／g或mmol／g、mg／ml或mmol／ml ) 732阳离子交换树脂一级品为4.2 mmol／g干树脂 交换容量的测定： 强酸型与强碱型测定其解离盐的能力； 弱酸型与弱碱型测定其中和酸碱的能力。 影响交换容量的因素： 筛孔、离子强度、pH值 。

  20. （1）强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法（1）强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用1mol／L的NaOH处理，去离子水洗至中性，1mol／L的HCl处理，去离子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的NaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。 计算公式如下：

  21. （2）强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法（2）强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用1mol／L的HCl处理，去离子水洗至中性，1mol／L的NaOH处理，去离子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的HCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。 计算公式如下：

  22. （3）凝胶或纤维类弱碱性或弱酸性离子交换介质换容量的测定方法（3）凝胶或纤维类弱碱性或弱酸性离子交换介质换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用1mol／L的NaCl处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的NaCl或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，按如下计算公式交换容量。

  23. 三、实验器材与试剂 1、设备 2、玻璃器皿 3、试剂与材料 4、离子交换剂用量的计算

  24. 1、主要设备　 ①梯度混合器1台（储液瓶250-500ml） ②层析柱1支（ф13mm×H30-40mm） ③恒流泵1台 ④部分收集器1台 ⑤分光光度计（共用） ⑥电子天平（共用） ⑦电炉 柱层析设备设备图片

  25. 柱层析设备 柱层析设备 梯度混合器 层析柱 部分收集器 可见光分光光度计 蠕动泵

  26. 2、玻璃器皿 ①试管50支及试管架 （ф10mm×H100mm） ②滴管2支 ③玻璃棒ф3mm1支 ④烧杯100ml×2， 500ml×2 ⑤量筒100ml×1 ⑥容量瓶250ml-500ml各1个 ⑦硅胶管ф4mm×1000mm ⑧输液器夹子等 主要玻璃器皿图片

  27. 3、试剂与材料 ① 苯乙烯磺酸钠型树脂(强酸1×8，100-200目) ②2 mol/L盐酸溶液。 ③2 mol/L氢氧化钠溶液。 ④标准氨基酸溶液： Asp、Lys和His各配制成4mg／mL的0.1mol/L盐酸溶液。 ⑤混合氨基酸溶液： 将上述Asp、Lys和His各溶液按1:3:10的比例混合。 ⑥檬酸-氧氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8，Na+0.45mol/L)。 取柠檬酸14.25g、氢氢化钠9.3g和浓盐酸5.25mL溶于少量蒸馏水后，定容至500mL，冰箱保存。 ⑦檬酸-氧氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8，Na+0.8mol/L)。 在pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L的檬酸-氧氧化钠-盐酸缓冲液加入氯化钠0.35 mol/L。 ⑧显色剂： 2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加蒸馏水至100mL。 ⑨50%乙醇水溶液。

  28. 四、离子交换柱层析的操作技术 1、离子交换树脂的选择 2、离子交换树脂的预处理 3、层析柱的准备（层析系统安装图） 4、离子交换柱的灌装 5、样品上柱与洗脱 6、分析与鉴定

  29. 1、离子交换树脂的选择 实践中阴离子交换剂的选择主要取决于被分离物质所带的电荷。 如果被分离物质带正电荷，则应选择阳离子交换剂； 如果被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂； 如果被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定的pH范围内所带电荷来选择交换剂。

  30. 离子交换剂的选择图

  31. 不同离子型交换剂的选择 选用何种类型离子交换剂? ----取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。

  32. 2、离子交换树脂的预处理和转型 目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团 ①预处理：将干的树脂浸过夜或搅拌2小时，使其充分溶胀，强酸型阳离子树脂用4倍体积的2 mol/L的盐酸浸泡1小时或搅拌半小时，倾去清夜，蒸馏水洗至中性。 （强碱型阴离子树脂用氢氧化钠处理） ②转型：欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4C1处理。作法同上，最后用蒸馏水洗至中性待用。

  33. 3、柱层析系统的组装

  34. 4、离子交换柱的灌装 ①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧； ②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液； ③将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液； ④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。 ④连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。 本实验柱床高16～20厘米的层析柱。 （防止空气进入凝胶床） 动画加样过程

  35. 5、样品上柱及洗脱 ①加样量的控制 　　　分析：1-2ml/100ml床体积， 　　　制备：10-30ml/100ml床体积 ②洗脱液的选择与梯度洗脱 ③柱层析加样操作示意图 ④离子交换柱层析实物连接

  36. ②洗脱液的选择与梯度洗脱 • 缓冲液pH的选择 • 缓冲液离子组成的选择 • 缓冲液离子强度的选择 本实验采用檬酸缓冲液 (pH5.8，Na+0.45---0.9mol/L)

  37. 缓冲液pH的选择 起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。 选用阴离子交换剂时，PH值一般比有效成分的pI高一个单位，选用阳离子交换剂时，PH值一般比有效成分的pI低一个单位， 选择缓冲液的离子强度和PH值，也可使有效成分与离子交换剂结合得不牢固，而杂质与离子交换剂结合得牢固。

  38. 缓冲液离子组成的选择 • 缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， • 采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液， • 　　如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 • 采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液， • 　　如：Tris • 缓冲液离子不影响被分离物的活性、溶解度、测定过程。

  39. 缓冲液离子强度的选择 起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol/L。 洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。 梯度溶液制备装置及形成的梯度变化（图） 线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱

  40. 产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化 C = CB -（CB - CA）（1 - V2/V1）B1/A1 CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。

  41. 线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱

  42. 离子交换装置连接示意图

  43. ③平衡 ①用低离子强度的初始缓冲液平衡离子交换柱，本实验用PH5.8的柠檬酸缓冲液平衡交换柱。 ②节流速为0.5mL/min，流出液达床体积的四倍时即可上样。

  44. ④柱层析加样操作示意图 1、平衡好的层析柱。 2、沿管壁将样品溶液小心加到床面上，应避免将床面冲起（本实验加入AA混合液0.25～0.5mL）。 3-4、打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液， 5-7、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。 8-9、最后加入3—4mL洗脱液于凝胶上。 10、连接柱层析系统，自动收集记录。

  45. ⑤氨基酸的洗脱 在梯度混合器的A/B池中分别加入低离子强度缓冲液（0.45M）和高离子强度缓冲液（0.9M）； 将层析柱与梯度混合器、部分收集器相连，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集80管左右。

  46. 6、分析与鉴定 ①向收集管（单号）中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再加1.5mL的50%乙醇溶液。放置10min。以收集液第二管为空白。 ②测定570nm波长的光吸收值。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线。 ③根据绘制洗脱曲线，取紧靠洗脱峰尖未显色的收集液，进行纸层析，根据标准氨基酸的层析位置判断洗脱曲线中各种氨基酸的洗脱顺序，确定三个峰为何种氨基酸。

  47. 五、实验结果与讨论 1、绘制氨基酸的洗脱曲线 2、判断各洗脱峰为何种氨基酸 3、离子交换技术的实际意义

  48. 六、思考题 1、离子交换剂有那几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？转型及再生的含义？ 2、梯度缓冲液液如何配制？直线形、凹形和凸形的梯度曲线是怎么形成的？ 3、在离子交换层析中，若以0.1～0.5mol/ml NaCl为梯度的Tris-HCl缓冲液作洗脱液（总体积200ml），求此液通过层析柱75ml时，NaCl浓度是多少？ 4、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4.0、6.0、7.5和9.0的蛋白质混合液的方案，并简述理由。

  49. 欢迎大家提意见

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