肿瘤的基因治疗

1. 肿瘤的基因治疗

2. 现已证明，肿瘤的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和凋亡失调的结果。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。现已证明，肿瘤的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和凋亡失调的结果。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。 •     目前，肿瘤基因治疗的主要途径包括：抑癌基因治疗，癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因（自杀基因）治疗，多药耐药基因治疗，肿瘤血管基因治疗等。  

3. 一.针对抑癌基因的基因治疗 • 研究表明，几乎一半的人类肿瘤均存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因的失活与肿瘤的生长有着密切的关系。因此，将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的抑癌基因治疗策略，必将成为肿瘤基因治疗中的一种重要的治疗模式。

4.  p53基因是1979年Lane和Grawford在SV40大鼠T抗原基因转染的细胞中发现的，是目前研究最广泛和深入的抑癌基因。其正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变。迄今已发现的10000种人类肿瘤的2500种基因突变中，p53蛋白的393个氨基酸就有280个以上发生了突变。这种点突变，直接导致氨基酸的改变，最终产生没有活性的p53蛋白，失去抑癌作用。

5. 鉴于人类恶性肿瘤p53基因突变率较高，以正常p53基因治疗肿瘤就成了研究的热点。大量的体内外试验已证实，引入p53基因确实可以抑制肿瘤细胞的生长，诱导其出现凋亡。2002年Kunihisa等利用电穿孔的方法，把野生型p53基因导入人类前列腺癌细胞PC-3中，发现肿瘤细胞形态改变，细胞生长速度降低，裸鼠致瘤性消失，进一步研究发现肿瘤抑制是因为其凋亡增加所致。Hagivara等将载有野生型p53的腺病毒载体直接进行瘤体内注射均可使动物的生存期明显延长。鉴于人类恶性肿瘤p53基因突变率较高，以正常p53基因治疗肿瘤就成了研究的热点。大量的体内外试验已证实，引入p53基因确实可以抑制肿瘤细胞的生长，诱导其出现凋亡。2002年Kunihisa等利用电穿孔的方法，把野生型p53基因导入人类前列腺癌细胞PC-3中，发现肿瘤细胞形态改变，细胞生长速度降低，裸鼠致瘤性消失，进一步研究发现肿瘤抑制是因为其凋亡增加所致。Hagivara等将载有野生型p53的腺病毒载体直接进行瘤体内注射均可使动物的生存期明显延长。

6. 二.针对癌基因的治疗 癌基因是指细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的一类基因。因此，这种基因在人的正常细胞中就已存在。在绝大部分情况下，这类潜在的癌基因处于不表达状态，或其表达水平不足以引起细胞的恶性转化，或野生型蛋白的表达不具有恶性转化作用。但是当这些基因改变时，就会导致基因异常活化而启动细胞生长，从而发生恶性转化。如Ras、Myc、Src等基因，由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传导途径，促使细胞异常生长。因此将癌基因反义序列导入癌细胞使之封闭，是抑制肿瘤的另一种方式。

7. Wei等用反义Myc(片段构建)重组腺病毒载体Ad-As-Myc，发现能显著抑制肺腺癌GLC-82和SPC-A-1细胞生长和克隆形成，并诱导其凋亡。RT-PCR和Western印迹显示MYC基因表达下降，凋亡相关基因Bcl-2和Bax分别出现下调和上调。瘤内注射Ad-As-Myc可抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长(抑瘤率为52％)。对肝癌细胞BEL-7402、HCC-9204、QSG-7701和SMMC-7721、胃癌细胞MGC-803、SGC-823均有抑制作用，表明反义Myc具有广谱的抗肿瘤作用。

8. 三.免疫基因治疗 • 1. 针对免疫应答细胞：常用的免疫细胞有两种：免疫效应细胞和树突状细胞。 • 2.  针对肿瘤细胞的免疫基因治疗

9. 免疫效应细胞介导的基因治疗 • 将细胞因子导入抗肿瘤效应细胞中以增强抗肿瘤作用，并以免疫效应细胞为载体将细胞因子基因携带至体内靶细胞，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能。常用的免疫效应细胞有TIL、LAK、Mφ、NK等，可供选择的目的基因有白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子等。在这些目的基因中，早期尤以IL-2的研究最多。Tam等根据NK细胞的杀伤活性及扩增能力等依赖于IL-2的特点，将IL-2基因转染至一株对多种肿瘤细胞具有杀伤作用的人NK细胞株NK-92(依赖外源IL-2)，构建了不再依赖外源IL-2的新型NK细胞株NK-92MI(高表达IL-2)及 NK-92CI(低表达IL-2)，发现NK-92MI及NK-92CI对肿瘤细胞株(K562、Raji等)的杀伤活性与NK-92相比无显著差异，也不影响正常的造血前体细胞的功能。

10. 此外，还有Nishihara等用反转录病毒载体将IFN-g、IL-4、IL-6或TNF-a等基因分别转染至小鼠细胞株J774A.1，发现该细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显增强。Mizuno等则将IFN-g基因转染至LAK细胞增强其杀肿瘤活性。此外，还有Nishihara等用反转录病毒载体将IFN-g、IL-4、IL-6或TNF-a等基因分别转染至小鼠细胞株J774A.1，发现该细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显增强。Mizuno等则将IFN-g基因转染至LAK细胞增强其杀肿瘤活性。

11. 树突状细胞介导的基因治疗 • DC细胞是人体最有效的APC，能致敏和激活静止T细胞和B细胞。T细胞直接或通过分泌细胞因子，B细胞通过分泌抗体，作用于靶细胞或病原体上，最终消灭靶细胞或病原体。最近几年，DC细胞作为肿瘤生物治疗和基因治疗的方案已获FDA批准并进入III期临床。该疗法比传统的LAK细胞疗法和CIK细胞疗法具有更特异及更强大的杀瘤活性，被誉为当前肿瘤生物治疗和基因治疗最有效的手段。

12. 比较成熟的制备DC细胞的方法是采用抗原基因、抗原和细胞因子来转染和修饰DC细胞。常用的有：①抗原肽刺激和各种抗原基因，如大肠癌-APC、CL3；宫颈癌-E7、E6; 前列腺癌-FTI-1、PSA等；②肿瘤提取物；③细胞因子。动物实验结果表明，转导肿瘤特异性抗原基因的DC细胞可使肿瘤组织减小。Wang等用小鼠肝癌总RNA转染的树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的研究发现，转染的DC其组织相容性分子(MHC-I、II)及共刺激分子(B7-1、B7-2)表达明显增高，刺激同基因型小鼠T细胞可使增殖能力增强，且还能诱导Hepa1-6肝癌细胞特异性的CTL产生。Fan等构建的AFP-DC（AFP，Alpha fetoprorein, 甲胎蛋白，在原发性肝癌中呈高表达）瘤苗不仅能产生和分泌AFP，而且还能上调自身的B7分子和MHC分子，明显刺激T细胞增殖及提高CTL的杀伤作用。

13.   DC细胞增强抗肿瘤免疫反应的另一机制是编码CD40配体的基因转录。CD40配体的表达可通过DC 已表达的CD40之间的相互作用自动激活，这可直接刺激抗原特异性的CD8＋T细胞而无需CD4＋T细胞的介导。事实上，在小鼠黑色素瘤中，这种机制可引起肿瘤退化，生存期限延长。Kikuchi等研究发现，同时向肿瘤内注射表达有CD40的腺病毒载体和改造过的DC，可引发肿瘤特异性的免疫反应，抑制肿瘤生长，并增加肿瘤CD40配体的表达。因此，肿瘤细胞转基因CD40配体的表达可明显增强DC表达CD40，从而增强其抗肿瘤活性

14. 针对肿瘤细胞的免疫基因治疗 • 增加肿瘤细胞表达细胞因子 • Shiau等用含IFN-γ的逆转录病毒进行膀胱癌切除后的免疫基因治疗，即增加肿瘤细胞在局部产生IFN-γ，以诱导淋巴细胞的反应而达到治疗目的。Hull等用伴有IL-12/B7（AdmIL-12）表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的RM-9鼠前列腺癌模型，发现在感染的RM-9鼠肿瘤细胞中AdmIL12/B7能介导IL-12分泌和增加B7-1在细胞表面的表达，明显减少肿瘤体积和增加鼠的存活率。Lv等用腺病毒介导的IL-2基因及B7-1基因联合转染G422胶质母细胞瘤，结果发现肿瘤生长明显减慢，脑内接种的动物存活期明显延长，NK、LAK和CTL的杀伤活性增强，说明IL-2基因转移确实能使肿瘤细胞的致瘤原性下降。 • 除了IL-2外，还有很多对其它细胞因子的研究，如IL-1、12、18、23等。

15. 免疫相关基因导入肿瘤细胞 • 肿瘤抗原需与MHC-I类分子结合，被CD8+CTL识别，被APC摄取加工后与MHC-II类分子结合，再被CD4+Th识别，方可激活肿瘤免疫。而MHC-I和MHC-II途径都需B7共刺激。肿瘤细胞低表达或不表达MHC-I或MHC-II及共刺激分子，是其抗原呈递发生障碍，最终逃脱机体免疫的重要原因。Chen等将人类乳头状瘤病毒(HPV-16)的E7基因转染黑色素瘤细胞株K1735，以期通过E7基因的表达来增强肿瘤细胞的免疫原性，再将B7基因转染该细胞株以增强肿瘤细胞所缺乏的共刺激信号，发现单纯转染了E7基因的肿瘤细胞在体内100％成瘤，而同时转染了E7和B7基因的肿瘤细胞在体内完全丧失了致瘤能力。进一步研究证明，通过B7-1基因转染的结肠癌在小鼠体内诱导产生了特异性杀伤细胞CTL。Kikuchi等将共刺激分子CD40基因的重组腺病毒直接注入小鼠黑色素瘤、结肠癌及Lewis肺癌等实体瘤内，发现60％以上的小鼠黑色素瘤及结肠癌得以治愈，而免疫原性极弱的Lewis肺癌也有部分治愈。对MHC基因转染后肿瘤细胞致瘤性的研究也有类似的报道。

16. 四、自杀基因治疗或酶药物前提疗法 • 自杀基因(Suicide gene)，就是可引起细胞死亡的基因；亦即将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有毒性的产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的，也称药物敏感基因(Drug sensitive gene)。

17. 常用的自杀基因包括：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Herpes simplex virus-thymidine kinase, HSV-tk)、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因(Varicella-zoster virus-thymidine, VZV-tk)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(E. coli-cytosine deaminase, CD)、细胞色素P-450基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Glunaine phosphoribosyl transfeRase, GPT)等。

18. 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSK-tk）基因是最有特点的自杀基因，它编码胸苷激酶，该酶可将核苷类似物(NA)代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物而发挥抗肿瘤作用。病毒源性的tk基因可催化抗病毒核苷类似物acyclovir(ACV), ganciclovir(GCV), bromovinydeoxyuridine(BDVdU), 这些前药不能在细胞TK的作用下磷酸化，因而其本身对细胞无毒或毒性很低。但HSV-tk基因导入细胞并表达后，生成特定的酶，这些酶将这些前药三磷酸化，转换成毒性产物，阻断核酸代谢途径，导致细胞死亡。Hall等的实验研究发现，把腺病毒介导的HSV-TK/GCV注射到有前列腺癌的小鼠体内，可明显抑制前列腺癌的生长，并能使癌的肺转移率降低约40％。Shalev等对治疗失败或发生转移的前列腺癌患者用此方法进行治疗，也取得了较好的临床效果。

19. 五、耐药基因治疗 • 多药耐药(Mulitiple Drug Resistance，MDR)是指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物产生耐药的同时，也对其它结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。MDR是影响肿瘤化疗疗效的重要因素之一。因此，如何消除MDR的影响，提高化疗药的药效就成了人们研究的热点。而耐药基因治疗就是针对此产生的，即将一些细胞毒药物的基因转移至造血干细胞, 以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可能用高剂量的药物杀死肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。 • 常用的耐药基因包括：MDR-1(Multidrug resistance 1)gene等。

20. 人类基因组中含有两个MDR基因，即MDR1和MDR2，二者有高度的同源性，但是MDR2不参与MDR的产生过程。MDR1基因组编码1280个氨基酸多肽(P-glycoprotein, P-gp，p糖蛋白)。现已证明，P-gp与耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein , MRP)密切相关。P-gp与ATP结合，利用ATP水解产生的能量进行跨膜转运，对疏水性抗肿瘤药(如actinomycin D等)有较强的外排作用。当P-gp与抗肿瘤药物结合后，通过ATP提供的能量，将药物从细胞内泵出细胞外，导致细胞内药物浓度不断下降，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，最终出现耐药现象。Wang等利用逆转录病毒载体高效介导抗MDR1核酶的基因进入有MDR1基因表达的肿瘤细胞中，发现转导的肿瘤细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性，阻断了MDR1 mRNA和P-gp的表达。临床上应用MDR1基因转移主要集中在骨髓干细胞。

21. 六、抗血管生成基因治疗 • 肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它所提供的氧气和营养物质。因此，早在1971年，Folkman等就提出可通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长，防止肿瘤的转移。因为在肿瘤的转移过程中，肿瘤血管的生成是必需的。这就使人们对与新血管生成和肿瘤血管成熟有关的前血管生成因子进行了大量的研究。

22. VEGF是肿瘤诱导血管生成过程中一个主要的调节因子，它可选择性刺激内皮细胞分裂，并能增加微血管的通透性。通过阻断VEGF的翻译和转录过程可使它的产生受到抑制。一种治疗方法就是引入一段反义VEGF的cDNA基因，通过与VEGF的mRNA结合，来抑制VEGF蛋白的翻译。

23. 七、问题与展望 • 基因治疗作为一种崭新的治疗手段，为攻克癌症带来了希望，从理论上说应该效果是很理想，但在实际应用中，还有很多问题有待解决。如（1）外源基因的表达效率问题。（2）外源基因表达调控问题。（3）在处理多系统基因紊乱过程中基因治疗的作用远未阐明；（4）基因治疗另一个潜在的风险是反转录病毒载体是随机地将外源基因插入宿主基因组，如果插入不当可能会破坏另一个基因表达或激活其它基因；另外在实验操作时有可能将辅助病毒污染重组病毒，造成病毒在宿主体内大量扩增。虽然基因治疗在临床上对部分肿瘤显示出较好的抗癌、抑癌作用，但是所使用的均是寿命较短的细胞，病人需要重复输入外源基因的细胞，致使医疗费用过高，难以普及，且其长期疗效和不良作用尚不清楚。因此，选择适宜的靶细胞以使基因治疗效果得以长期维持，一劳永逸地解决肿瘤治疗问题是基因治疗的发展方向。

24. 在后基因组时代各种肿瘤基因治疗都有各自的策略。目前基因治疗重点有以下几个方面：（1）联合基因治疗（2）增强肿瘤的免疫反应（3）修复细胞周期中因肿瘤抑制基因丧失或癌基因激活而造成的细胞DNA损伤（4）自杀基因治疗，基因标记研究与在基因治疗中对正常组织的保护措施等。在这些热点研究中，联合基因治疗及自杀基因与其它疗法联合应用为重中之重，因为这不但符合肿瘤发生发展的规律，而且也弥补了单基因、单一疗法应用的不足。因此认识到肿瘤发生的复杂性及机体在此过程中千变万化的状态，选择适合的治疗方式，从多方面入手，达到几种治疗方式的相辅相成，或建立治疗的个体化方案，才能使目前的基因治疗具有突破性的发展，基因治疗才能真正用于临床，造福于肿瘤患者。在后基因组时代各种肿瘤基因治疗都有各自的策略。目前基因治疗重点有以下几个方面：（1）联合基因治疗（2）增强肿瘤的免疫反应（3）修复细胞周期中因肿瘤抑制基因丧失或癌基因激活而造成的细胞DNA损伤（4）自杀基因治疗，基因标记研究与在基因治疗中对正常组织的保护措施等。在这些热点研究中，联合基因治疗及自杀基因与其它疗法联合应用为重中之重，因为这不但符合肿瘤发生发展的规律，而且也弥补了单基因、单一疗法应用的不足。因此认识到肿瘤发生的复杂性及机体在此过程中千变万化的状态，选择适合的治疗方式，从多方面入手，达到几种治疗方式的相辅相成，或建立治疗的个体化方案，才能使目前的基因治疗具有突破性的发展，基因治疗才能真正用于临床，造福于肿瘤患者。