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核酸含量测定

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核酸含量测定

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Presentation Transcript

  1. 核酸含量测定 定磷法

  2. 核酸定量测定常见的方法 • 1. 定磷法:将核酸消化,测定其无机磷量,由此计算出核酸含量,反应灵敏。 • 2. 紫外吸收法:利用核酸在260nm处有吸收高峰,操作简便,受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 • 3. 地衣酚法:用于测定RNA的含量,RNA与浓盐酸共热,降解形成的核糖转变为糠醛,利用地衣酚反应来测定,特异性差,戊糖均有此反应。 • 4. 二苯胺法:DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛,利用二苯胺试剂反应,除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。

  3. Vit • C 定磷法的原理 首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷,利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为: • (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 • H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O • H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 •MoO3(钼蓝)

  4. 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值,当无机磷含量在1—25μg 范围内,光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%,即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA的含磷量平均为9.9%。

  5. 试剂 • 酵母RNA样品溶液:2000μg/mL • 标准磷原液:含磷量为1000 μg/mL • 标准磷溶液:含磷量为10 μg/mL,每组用干试管取15mL • 定磷试剂:含硫酸、钼酸铵、Vit.C,浅黄色,如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL

  6. 实验步骤 1. 核酸样品用硫酸消化,将有机磷转化成无机磷; 2. 制定定磷标准曲线; 3. 测定回收率和样品总磷量。

  7. 1. 样品消化(每两组或三组做一份)

  8. 2. 定磷标准曲线的制定(每人做一份) 每人取18支试管,按照下表平行操作:

  9. 3. 测定总磷量和回收率(与2同时进行)

  10. 数据处理 • 关于空白: 1—6号管用于绘制定磷标准曲线,1号管作为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定,7号管作为空白。 • 以每管含磷量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标画标准曲线,直线应过原点。 • 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。

  11. 计算回收率: • (2) 计算样品总磷量: • (3) 计算RNA量: • (4) 样品RNA含量:

  12. 操作注意事项 1. 每人独立操作,不允许两人穿插取样; 2. 要求试剂及所有器皿清洁,不含磷; 3. 每管加样和测定均要求平行操作; 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样; 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取,移液管口用吸水纸擦净,溶液尽量加到试管下部,标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用:用点动档,试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时,用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点,另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定,不用润洗,切忌甩比色杯,将蓝色溶液撒在仪器和地面上。

  13. 思考题 • 1. 回收率的意义; • 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。

  14. 实验结束 • 将试管洗净,斜插在试管架上,放在台面上。 • 将消化管和橡皮塞洗净,放回原处。 • 将比色杯洗净,放在实验台上的小平皿中。 • 将实验台面擦干净。