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高效液相色谱法检测 白藜芦醇及其糖苷四种异构体

高效液相色谱法检测 白藜芦醇及其糖苷四种异构体. 答辩人： 曾玮 指导老师：马志玲 副教授. 目录 . 前言 实验 结果与讨论 结论 展望. 一、前言. 选题意义 国内外研究现状 创新之处. 1.1 选题意义. 白藜芦醇 (Resveratrol) 白藜芦醇苷 (Resveratrol glucoside ). 反式白藜芦醇 顺式白藜芦醇 反式白藜芦醇糖苷 顺式白藜芦醇糖苷. 图 1 白藜芦醇及其糖苷四种异构体的化学结构. 白藜芦醇的药理作用. 抗癌作用 预防动脉粥样硬化作用 抗细菌、抗真菌作用 抗休克作用 镇咳平喘作用.

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高效液相色谱法检测 白藜芦醇及其糖苷四种异构体

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Presentation Transcript

  1. 高效液相色谱法检测白藜芦醇及其糖苷四种异构体高效液相色谱法检测白藜芦醇及其糖苷四种异构体 答辩人： 曾玮 指导老师：马志玲 副教授

  2. 目录 • 前言 • 实验 • 结果与讨论 • 结论 • 展望

  3. 一、前言 • 选题意义 • 国内外研究现状 • 创新之处

  4. 1.1 选题意义 白藜芦醇(Resveratrol) 白藜芦醇苷 (Resveratrol glucoside ) 反式白藜芦醇顺式白藜芦醇反式白藜芦醇糖苷顺式白藜芦醇糖苷 图 1 白藜芦醇及其糖苷四种异构体的化学结构

  5. 白藜芦醇的药理作用 • 抗癌作用 • 预防动脉粥样硬化作用 • 抗细菌、抗真菌作用 • 抗休克作用 • 镇咳平喘作用

  6. 白藜芦醇的药用价值与保健功效受到人们的日益重视，具有重要的研究价值。白藜芦醇的药用价值与保健功效受到人们的日益重视，具有重要的研究价值。 • 本文对红葡萄酒、虎杖中白藜芦醇分析检测方法进行研究，对指导白藜芦醇的利用和评价白藜芦醇含量提供依据。

  7. 1.2 国内外研究现状 • 气相色谱法 • 毛细管电泳法 • 高效液相色谱法

  8. 1.3 创新之处 • 分别对红葡萄酒和虎杖样品的梯度洗脱条件进行了研究。 • 比较了不同的萃取方法，从红葡萄酒中萃取白藜芦醇及其糖苷四种异构体，确定最佳的预处理条件。 • 应用微波破壁-溶剂提取-HPLC法检测虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷，大大节省了分析时间。

  9. 二、实验部分 • 仪器 • 试剂 • 色谱条件 • 实验方法

  10. 2.1 仪器 • 1100型高效液相色谱仪 （Agilent公司）,配有二极管阵列检测器 • 化学工作站（Agilent ChemStation for LC 3D） • QW-2HO型多管微波机（箱式） • ZF-3型三用紫外仪 • 旋转蒸发仪

  11. 2.2试剂 • 反式白藜芦醇纯品，经HPLC检验纯度>99.99% • 反式白藜芦醇苷纯品， 经HPLC检验纯度>99.9% • 顺式白藜芦醇及其糖苷的标准品由其相应的反式化合物经紫外光照射，HPLC检测纯度获得 • 流动相，甲醇（HPLC级）, 双蒸水 • 其余试剂均为分析纯

  12. 2.3 色谱条件 • 色谱柱 Hypersil ODS （5mm ID 4.0mmｘ200mm）配有C18保护柱 • 流动相为 MeOH和H2O • 柱温为30℃ , 流速为0.8mL/min • 检测波长： 288nm（顺式白藜芦醇和苷) 306nm（反式白藜芦醇和苷） • 分别采用梯度A,B分析检测白藜芦醇及其糖苷四种异构体

  13. 表1-1分离红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷四种异构体的梯度A表1-1分离红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷四种异构体的梯度A 表1-2分离虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷的梯度B • 淋洗梯度

  14. 图2①梯度B分离白藜芦醇及其苷四种异构体的色谱图② 梯度A分离白藜芦醇及其苷四种异构体的色谱图

  15. 2.4 实验方法 • 红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷的4种异构体的分离测定 适量红酒 乙酸乙酯萃取 HCl调PH值至2 低温旋干 甲醇溶解 滤膜过滤 HPLC检测

  16. 虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷的2种异构体的分离测定虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷的2种异构体的分离测定 适量虎杖 水浸泡 微波辐照 无水乙醇水浴回流 酸水解 定容 滤膜过滤 HPLC检测

  17. 三 结果与讨论 • 色谱梯度洗脱条件优化 • 红酒预处理条件优化 • 白藜芦醇及其糖苷的标准曲线 • 回收率与方法最小检出量 • 五种不同红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷四种异构体检测 • 虎杖的预处理条件优化 • 虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷的测定 • 虎杖微波破壁后醇提与传统醇提方法比较

  18. 3.1 色谱梯度洗脱条件优化 图3 用梯度A分离红酒实际样品色谱图 图4 用梯度B分离虎杖实际样品色谱图 A——反式白藜芦醇苷，B——反式白藜芦醇，C——顺式白藜芦醇苷 D——顺式白藜芦醇；色谱条件如上文所述 A——反式白藜芦醇苷， B——反式白藜芦醇， 色谱条件如上文所述

  19. 3.2 红酒预处理条件优化 • 液液萃取 和固相萃取比较 • 液液萃取溶剂条件优化 • 液液萃取PH值条件优化

  20. 3.2.1液液萃取 和固相萃取 mg/L 图5 固相萃取法与液液萃取法 研究波尔多红酒中白藜芦醇及苷的四种异构体萃取效率

  21. 3.2.2液液萃取溶剂条件优化 mg/L 图6不同萃取剂对波尔多红酒中白藜芦醇及其糖苷四种异构体萃取效率的影响

  22. 3.2.3 液液萃取的PH值优化 PH2 PH3 PH5 PH7 PH9 图7 PH值对波尔多红酒中四种异构体萃取效率的影响

  23. 红酒预处理优化条件 • 取适量红葡萄酒，用HCl调其pH值至2，用三倍体积的乙酸乙酯分三次萃取，分出有机层。合并有机层, 低温旋干，50%甲醇水溶液溶解，0.45m滤膜过滤，hplc检测。

  24. 3.3 标准曲线 表3 白藜芦醇及其苷四种异构体的标准曲线及相关系数

  25. 3.4 回收率实验与最小检出量 • 反式白藜芦醇及其糖苷的回收率分别为 94.6%、97.8%。 • 最小检出量（对梅洛红红酒进行检测 n=5） 反式白藜芦醇苷：1.02 mg/mL 反式白藜芦醇：0.7 mg/mL 顺式白藜芦醇苷：1.04 mg/mL 顺式白藜芦醇：0.45 mg/mL

  26. 3.5 红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷的四种异构体测定 表2 五种不同红酒中白藜芦醇及苷四种异构体的含量

  27. 3.6 虎杖的预处理条件优化 • 本文采用正交设计法(L34)对微波破壁-溶剂提取的方法进行优化，最终确定了虎杖预处理的最佳条件。

  28. 3.7 中草药虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷的测定 • 经比较酸水解前后反式白藜芦醇含量的变化换算得到虎杖中反式白藜芦醇苷的含量。 表4 虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷的含量

  29. 图8 ①未水解的，其余步骤按2．5．1进行的虎杖提取液 ②在盐酸浓度5%，温度90℃水浴加热回流1h的水解条件下水解后的虎杖提取液色谱图 A——反式白藜芦醇苷 ，B——反式白藜芦醇， C——顺式白藜芦醇苷 ，D——顺式白藜芦醇；色谱条件如正文。

  30. 3.8 微波破壁后醇提与传统醇提比较 • 传统回流提取率是微波破壁后再乙醇提取的提取率的约1/3。证明经过微波破壁，可以明显改善随后的溶剂提取的效果。

  31. 4.结论 • 对于萃取红酒中白藜芦醇及其苷的四种异构体，液液萃取法萃取率优于固相萃取法，液液萃取法中又以使用乙酸乙酯为萃取溶剂最优。 • 采用微波破壁-溶剂提取-HPLC法检测虎杖中白藜芦醇及其糖苷，大大节省分析时间。

  32. 5. 展望 • 进一步改善优化红葡萄酒的萃取条件，并寻求快速、高效的红酒预处理方法。 • 对影响微波破壁的各个因素进行进一步的研究，掌握更多的实验数据

  33. 致谢 本文在导师马志玲副教授的指导下完成， 并得到吴京洪老师、邹世春副教授的大力支持，00级研究生欧阳姗的热心帮助，特此表示衷心感谢。

  34. 谢 谢 !

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