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细胞生物学技术

细胞生物学技术. 刘 红 亮 2006.10.14. 细胞生物学技术. 掌握显微镜技术和细胞培养技术 （重点） 了解常用技术的步骤及其目的 （重点） 了解新技术及其使用目的. 第一节 显微技术. 光学显微镜技术（重点） 电子显微镜技术 显微操作技术 光学显微镜技术. 普通光学显微镜. 1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置. 概念－分辨率. 分辨率 ： 指分辨物体间最小间隔的能力。 R=0.61λ/ N．A．

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细胞生物学技术

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  1. 细胞生物学技术 刘 红 亮 2006.10.14

  2. 细胞生物学技术 • 掌握显微镜技术和细胞培养技术（重点） • 了解常用技术的步骤及其目的（重点） • 了解新技术及其使用目的

  3. 第一节 显微技术 • 光学显微镜技术（重点） • 电子显微镜技术 • 显微操作技术光学显微镜技术

  4. 普通光学显微镜 1. 构成： • 照明系统 • 光学放大系统 • 机械装置

  5. 概念－分辨率 • 分辨率：指分辨物体间最小间隔的能力。 • R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 • 思考：如何提高显微镜的分辨能力？

  6. 表一、几种介质的折射率

  7. 显微镜的几个光学特点 • 以可见光为光源的显微镜，空气为介质，分辨率为0.2µm • 人眼的分辨率为0.1mm,所以光学显微镜的设计放大倍数为500 • 通常将普通光镜下所见物体的结构称为显微结构

  8. 光学显微镜的辅助技术 • 染色 • 固定 • 切片

  9. 倒置显微镜inverse microscope • 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 莱卡倒置显微镜

  10. 荧光显微镜 • 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光 • 另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光 • 荧光显微镜就是对细胞内这类物质进行定性和定量和定位研究的工具之一。

  11. 荧光显微镜的特点 • 光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； • 有两个特殊的滤光片； • 照明方式通常为落射式。

  12. 尼康E800 荧光DIC 显微镜

  13. 荧光显微镜照片 微管呈绿色、微丝红色、核蓝色

  14. 相差显微镜 • 相差显微镜由P．Zernike 于1932年发明，并因此获1953 年诺贝尔物理奖。 • 这种显微镜最大的特点是可以观察未经 染色的标本和活细胞。

  15. 暗视野显微镜 • 聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 • 利用这种显微镜能见到小至 4~200nm 的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50 倍。 • 适合观察细胞内的细胞核、线粒体以及液体介质中的细菌和真菌

  16. 显微摄影技术 • 细胞运动很慢难以在短时间内观察 • 一定时间间隔自动拍摄记录，已正常速度放映，加快所拍摄情节 • 观察活细胞的运动

  17. 激光共聚焦扫描显微境 • 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 • 能显示细胞样品的立体结构。 • 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 • 用途类似荧光显微镜，检测发射荧光和荧光标记物质的三维结构

  18. 激光共聚焦扫描显微镜

  19. LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) http://www.itg.uiuc.edu/

  20. 当代显微镜的发展趋势 进入20 世纪80 年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。

  21. 电子显微镜技术 • 电子显微镜以电子束为光源，光学显微镜以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源。 • 电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM 的分辨力可0.2nm。 • 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm 的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构 • 电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本需要用超薄切片机制作厚度约50nm 左右的超薄切片。

  22. 透射电子显微镜 • 电子显微镜通常指透射电子显微镜transmission electron microscope，TEM • 镜桶内是真空，避免电子与空气中的分子碰撞而发生散射 • 样品密度大的地方电子散射多形成暗区，反之形成明区 • 样品需要固定，切片，浸染，然后放在载网上观察

  23. 样本的反差决定于组成分子的原子序数，原子序数越高反差越大，生物分子的原子序数低，所以用重金属如锇铀铅等盐类浸染样本的反差决定于组成分子的原子序数，原子序数越高反差越大，生物分子的原子序数低，所以用重金属如锇铀铅等盐类浸染 • 细胞的不同成分对盐类有不同的亲和力，根据观察的目的确定浸染盐类，锇对脂质有较高的亲和力，常在观察膜性结构是浸染标本 • 增强电压可以观察较厚的样品，由此产生了高压电镜

  24. 透射电子显微镜 JEM-1011 透射电子显微镜

  25. 莱卡超薄切片机

  26. 内质网透射电镜图

  27. 电镜辅助技术 • 超薄切片通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差 • 负染技术负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm 左右

  28. 冰冻蚀刻冰冻蚀刻亦称冰冻断裂。 • 标本置于-100°C的干冰或-196°C 液氮中，进行冰冻。 • 用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。 • 向断面以45 度角喷涂一层蒸汽铂，再以90 度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构 • 有显著的断面浮雕效果

  29. 冰冻蚀刻电镜照片

  30. 扫描电镜技术 • 目前扫描电镜的分辨力为6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm 的光点，则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X • 可以直接观察标本表面的三维形态 • 分辨率不如透射电镜，多用于细胞整体和组织

  31. Scanning electron microscope（ SEM）

  32. 人类血细胞

  33. 酵母

  34. 人类精子

  35. X射线衍射技术 • 用衍射图分析分子的内部结构，所用射线的波长必须小于分子内原子的距离 • X射线的波长约为0.1nm,等于氢原子的直径，适合用来研究分子内原子的排列，高分辨率的电镜也无能为力。 • 具有比电子更强的穿透力，可以分析较厚的样本 • 不需要真空，可以分析含水份的样本，避免样本在制作中失真。

  36. 使用分子整齐排列的蛋白质晶体是研究分子结构的必备条件使用分子整齐排列的蛋白质晶体是研究分子结构的必备条件 • 晶体可以增加受到照射是散发射线的总量 • 研究分子结构的困难在于获得高质量的晶体 • X衍射是确定分子内原子排布的唯一方法

  37. 核磁共振技术 • 核磁共振光谱仪（NMR）早期用于小分子结构分析 • 现在NMR可以研究蛋白质和RNA的三维结构以及糖蛋白中复杂的糖侧链结构 • 可以研究蛋白质分子间的相互作用 • 不需晶体，可以用蛋白质的浓缩溶液测定

  38. 膜片钳记录 • 用微电极测定膜的小领域内通道蛋白的离子转运功能 • 唯一即时研究单一蛋白质分子功能的技术 • 可以通过研究因离子浓度变化而发光的蛋白质分子指示剂来研究离子浓度的变化

  39. 向细胞内导入分子的方法 • 微量注射 • 电休克 • 脂质体转染 • 磷酸钙转染 • 葡聚糖转染

  40. 细胞的分离 • 目的从含有多种细胞的组织中获得单一类型的细胞 • 制备细胞悬液，用蛋白酶水解或金属离子螯合剂（乙二胺四乙酸，EDTA）螯合钙离子 • 分离特定细胞 • 单一细胞培养

  41. 单一细胞分选方法 • 通过细胞的大小、形状和密度不同离心分选 • 对特定材料（玻璃、塑料）的吸附能力不同吸附分选 • 通过抗体亲和表面分选 • 流式细胞仪流动筛选

  42. 细胞分离技术－离心技术 • 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。 • 转速为10~25Kr/min 的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。 • 目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。

  43. 差速离心 • 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器 • 细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。 • 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。 • 通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

  44. 密度梯度离心 • 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 • 这类分离分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。 • 分离细胞介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH 中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒,密度梯度离心常用介质：氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

  45. 速度沉降 • 主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 • 这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 • 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不 同的速度沉降而达到分离。

  46. 平衡沉降 • 适用于分离密度不等的颗粒，与大小形状无关 • 细胞或细胞器在连续密度梯度的介质中经大离心力和长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 • 需要高速或超速离心，离心时间也较长，对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤 • 适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。

  47. 流式细胞术 • 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 • 在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群。 • 包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪

  48. 细胞培养 • 细胞培养是从活体组织分离某一特定的细胞，在一定的条件下培养，使其继续生存、生长、增殖的方法 • 细胞培养中必须严格无菌 • 细胞系可以冻存与复苏

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