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第五章 分子生物学研究法

第五章 分子生物学研究法. 5.1 重组 DNA 技术发展史上的重大事件 5.1.1 主要三大成就 1. 40 年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是 DNA 而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 2. 50 年代提示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制 , 解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3. 50 年代末至 60 年代，相继提出了 " 中心法则 " 和操纵子学说 , 成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。. 5.1.2 主要事件. 5.1.3 重组 DNA 实验中常见的主要工具酶. 基因工程中常见的名词：

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第五章 分子生物学研究法

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Presentation Transcript

  1. 第五章 分子生物学研究法

  2. 5.1 重组DNA技术发展史上的重大事件 5.1.1 主要三大成就 1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 2. 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

  3. 5.1.2 主要事件

  4. 5.1.3 重组DNA实验中常见的主要工具酶

  5. 基因工程中常见的名词： 遗传工程--genetic engineering 基因操作--gone manipulation 基因克隆--gone cloning 重组DNA技术--recombinant DNA technology 分子克隆--molecular cloning

  6. 5.1.4 基因工程的主要内容或步骤 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

  7. 5.2 基因操作的主要技术原理 5.2.1 核酸的凝胶电泳 (Agarose & Polyacrylamide) 1. 电泳原理 某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。

  8. 2. 琼脂糖凝胶电泳 在琼脂糖凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 Agarose的分离范围在50bp(4.0%)—数十kb(0.3%) Polyacrylamide(PAGE) 1(20%)—1000bp(4%)

  9. 3. 脉冲电场电泳技术（PFGE） （Pulse-field gel electrophoresis） 用于分离超大分子量DNA。

  10. 5.2.2 核酸的分子杂交 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到滤膜上的。 常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。

  11. 核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。

  12. Southern凝胶转移杂交技术

  13. A C B M bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237

  14. Southern凝胶转移杂交技术Southern凝胶转移杂交技术Southern凝胶转移杂交技术Southern凝胶转移杂交技术 用荧光法检测核酸杂交信号

  15. 5.2.3 细菌转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。 对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ug DNA可得107-108个转化子。

  16. 5.2.4 核酸序列分析 1. Sanger双脱氧链终止法 • 末端终止法--待测单链DNA模板、引物、四种dNTP(其中一种用32P/35S标记)、终止剂(ddNTP)、DNA聚合酶。 • Sanger发明：两次获得诺贝尔奖。 • 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段。

  17. 2. Maxam-Gilbert化学修饰法 硫酸二甲酯特异性切割G，甲酸特性性切割G和A; 肼在NaCl条件下专门切割C，而无NaCl时专门切割T和C。

  18. 3. DNA序列分析的自动化

  19. 4. DNA杂交测序法（SBH）

  20. 5.2.5 基因扩增

  21. 反向PCR

  22. 5.2.5 DNA与蛋白质相互作用研究 1. 凝胶阻滞试验(gel retardation assay)

  23. 2. DnaseⅠ足迹试验 (DNA foot-printing assay)

  24. 5.3 基因克隆的主要载体 5.2.1 主要的克隆载体(vector) DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表达。 分为克隆载体和表达载体。 大肠杆菌质粒载体 噬菌体质粒载体 柯斯质粒载体 pBluescript噬菌粒载体

  25. 5.2.2 主要的质粒载体 质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 • 理想的质粒 • 拷贝数多; • 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z)筛选标志 • 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)，如EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)。

  26. 5.2.3 其它主要载体 • λ噬菌体(λphage) • 基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区 • DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb • 常用：EMBL 系列、 λgt 系列、charon系列 • 柯斯质粒(cosmid)： λDNA的 cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kb • M13噬菌体 • 最大优点：产生单链DNA

  27. 5.4 基因的分离与鉴定 5.4.1 DNA片段的产生与分离 5.4.2 重组体DNA分子的构建 5.4.3 cDNA基因克隆 5.4.4 克隆基因的分离

  28. 5.4.1 DNA片段的产生与分离 5.4.2 重组体DNA分子的构建 1. 外源DNA片段定向插入载体分子 2. 最佳连接反应 3. 重组体分子导入受体细胞的途径

  29. 5.4.3 cDNA基因克隆 5.4.4 克隆基因的分离 1. 核酸杂交筛选法 2. DDRT-PCR差异显示法 3. 应用cDNA差示分析法 4. 应用酵母双杂交体系法 5. 基因的图位克隆法 6. 用DNA微列阵技术

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