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因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製

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因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製 - PowerPoint PPT Presentation


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Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope ( UV-VIS ) 雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡 簡易使用流程 ( modified by Dr. Chien). 因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製 TEL : 02-2808-1452 / E-mail : [email protected]

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Presentation Transcript
leica tcs sp2 confocal spectral microscope uv vis modified by dr chien
Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope ( UV-VIS )雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡簡易使用流程(modified by Dr. Chien)

因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程

僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考.

然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人

使用中的樣品為唯一準則.

美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製

TEL : 02-2808-1452 / E-mail : [email protected]

緊急聯絡 : 0933-267 613 ( 24 hours on-call )

slide2
系統簡介 :

共軛焦掃描器

( 請參考光路圖 )

螢光燈源_汞燈

Ar/Kr雷射調整旋鈕

螢光濾鏡轉盤

穿透光燈源

鹵素燈

雷射電源開關

供電電源開關

防震桌

影像掃描擷取操控旋鈕

( Control Panel )

可見光雷射系統 及 電路控制系統

UV 雷射 : 另有獨立的供電開關

反射 / 螢光 及 穿透光光源

的切換開關

顯微鏡總電源開關

slide3
分光菱鏡

掃描器冷卻裝置

分光鏡

螢光感測用 PMT

( 依組配有 1 – 4 個

Channel )

鏡頭瞳孔照明

之光徑調控鏡

UV 光針孔鏡

Pinhole lens

多光子

螢光影像

感測用的

附加光電

倍增管

PMT

K-Scanner

穿透光影像感測 PMT ( Phase contrast, DIC )

Z-軸掃描

slide4
Step 1開機流程 :

可見光雷射

系統電源

UV 雷射電源

  • 開機注意事項 :
  • 確定電源為 AC220 V.
  • 確定冷氣空調開啟.
slide5
Step 2

打開顯微鏡燈源

1. 螢光用汞燈

2. 穿透光用鹵素燈

開機流程 :

2. 按右邊的顯微鏡總電源開關

( 左邊為 上下 鹵素燈源的切換開關 / Halogen 12V / 100W )

  • 按下汞燈開關
  • 置於桌下 / Hg 50 W –
  • * 汞燈開關使用間距至少須達 30 分鐘以上
  • * 汞燈使用壽命一般為 100 小時, 然而, 必須視實際燈管效益而定.
  • 更換時, 請由專人更換調整. 未經許可, 勿擅自動手.
slide6
Step 3

開啟共軛焦供電系統

開機流程 :

請依序 1 – 7 按序開機

6

5

4

  • Scanner_掃描器電源
  • 電腦電源
  • Ar 雷射電源
  • He-Ne 雷射 ( Red )
  • 電源
  • ( 鑰匙往右扳下 )
  • He-Ne 雷射 ( Yellow )
  • 電源
  • ( 鑰匙往右扳下 )
  • 啟動 Ar 雷射,鑰匙
  • 往右扳至 Start
  • 位置, 再往左扳回
  • 至中點位置

首先按下

Scanner 鈕,

開啟掃描器

電源

7

3

1

2

  • UV Laser 351 nm/ 364nm(* UV laser 請由專人開啟) 
  • Ar Laser 458 nm / 488 nm
  • He-Ne Laser 543 nm 
  • He-Ne Laser 633 nm

7. 啟動 Ar 雷射, 調整旋鈕

轉到 12 點鐘位置

slide7
檢視樣品

Step 2 :

光路控制拉桿推入 VIS 位置, 用眼晶觀察樣品

Step 3 :

選用適當的螢光濾鏡

“ 2 ” = I2 ( FITC )

“ 3 “ = N2.( Rodamine )

Step 1 : 調焦

使用電控升降載物檯, 將樣品

移至近焦距處, 用微調旋轉鈕

調焦.

使用浸漬油時, 不能有氣泡產生.

Step 4 :

將 Tube lens 轉到

UV-Scan 的位置

Step 5 :

聚焦後, 將汞燈柵門關掉,

避免汞燈過度曝晒樣品,

造成螢光漂白

slide8
啟動軟體

電腦啟動後, 螢幕會顯示告知, 按下 [ Ctrl _ Alt _ Del ]

然後, 不用輸入 Password, 即進入 Windows NT 系統

如果有設密碼 : User : [administrator] / Password : [admin]

啟動軟體 ( 以滑鼠點選, 按二下 )

電腦會自動起始化

掃描過程中, 請勿觸碰顯微鏡 及 防震桌 !

start dialog
Start dialog

選取

由於系統啟動後, 掃描器會自動校準, 顯微鏡的 Z-掃描台會自動歸零,

而焦距有所位移. 所以, 有時, 必須再看一下顯微鏡下的樣品, 是否有在聚焦位置 ?

slide10
A. 顯微鏡觀察及調焦

B. 選用螢光感測光譜設定 … [ Acquire ] … [ Beam ]

C. 設定基本掃描參數 .. [ Obj ] .. [ Mode ] .. [ Format ] .. [ Speed ]

D. 設定 Panel Box 的調控參數 與 配置位置

E. 依序執行影像擷取功能

Continuous scan ( 連續掃描 _ 取得最佳調控 )

Single scan ( 單一 2D 影像擷取 )

Series scan ( 連續斷層 3D 影像擷取 )

F. 儲存結果 與 進階影像處理, 量測, 編輯, 輸出列印.

slide11
啟動軟體之前的注意事項 :

如果已完成一般顯微鏡的鏡檢及聚焦, 請依序執下列操作 :

6. 轉至 UV-Scanner 位置 ( 如有 UV-laser 裝置 )

4. 往外拉至 TCS

1. 先開 Scanner

2. 再開 PC

5. 轉至 “ 4 ” Scanner 的位置

3. 開啟雷射電源, Ar 雷射調整旋鈕

轉到 12 點鐘位置

* UV laser 請由專人開啟

slide12
注意 :

請留意每一個小 [ 圖示區 ] 的位置, 因為底下的控制版面是

可更改設定與移動的. 所以, 使用人員必須先行清楚每一

圖示區的放置位置. ( 未經允許, 請勿擅自更改圖示區的配置 )

圖示區 : Control Button ( 可編輯, 可認意組配安置 …..

您現在使用中的圖示區安排可能與本圖示配置不同 )

slide13
Control Panel 的位置與參數設定

檔案管理 ( 存取 )

Control Panel 有 7 個對應位置, 針對每一個

對應位置, 設定所要使用的控置參數

以滑鼠按一下, 即可得到參數選單.

PMT Gain 1/2/3/4

Z-focus

Zoom

Pinhole

acquire beam
選取 [ Acquire ].. [ Beam ]

L :

代表原廠設定

無法變更設定

U :

代表使用者設定

可變更設定

選取應用設定

設定光路及螢光感測光譜範圍

如果要自行設定條件及一個專屬應用檔名

則, 僅按 SAVE 後, 輸入檔明即可.

slide15
Glow, Glow (Over)訊號感測超過閥值, 會警示與變藍色

Glow (Under), Glow (Over &Under)

Active

參數設定

如果應用為

綠色 及 紅色

兩種顯色

光路徑

分光鏡

可見光雷射調控 ( AOTF )

選用雷射波長

調整雷射強度

螢光釋放波長

雷射激發波長

光譜範圍調整

可自行調整光譜範圍

或 選用 PMT.

穿透光影像

感測用 PMT

Active

表示選用螢光

感測 PMT

選取 Glow ( O )

slide16
基本掃描參數設定

在完成 [ Acquire ] – [ Beam ] 設定後 :

選取 單向掃描 ( Unidirection )

如果按下滑鼠, 則為雙向掃描

5.選 Airy 1

1. 選取 XYZ 掃描模式

4.選取 400

Medium

3. 選 512 x 512

7. 選取 8 bits

6. Zoom 選取 1

2. 選取所使用中的物鏡

如 PL-APO 63x / 1.32 Oil

完成上列基本設定後, 即可開始執行連續掃描 ( Continuous scan )

slide17
連續掃描 ( Continuous scan )

移動掃描中的影像

快速調整 PMT 感測

的 gain, 以藍色顯示

出現一點點為最佳狀態

此位置應設為 “ Z “ 軸調控.

存取個人

Panel-Box

設定

調整聚焦, 讓影像清析

小小技巧 :

除了 PMT 及 Z-focus 調整外, 也可調整雷射強度, 光譜感測範圍, 或 Pinhole 大小, 或改變 PMT 的 Offset. 如果, 在經過上列的基本調整後, 已可取得不錯的影像, 則可再按一下 [ Continuous ] scan , 即可取得影像, 供儲存.

如果, 影像仍然有雜訊或不夠銳比, 則可考慮再使用平均 ( average ) 的擷取處理. Averaging 1 – 64 範圍, 可供選取使用, 供影像擷取的平均化, 以消除雜訊 ( 但, 易光漂白的染劑不適用此法 )

slide18
影像調控 顯示視窗

如果應用為 3-ch.

( FITC / TRITC / Cy5)

則第 4 個 ch. 顯示區

為 3-ch Overlay 所用

ch1

ch2

調控參數即時顯示

1

按一下滑鼠右鍵,

可更改顯示顏色

Overlay

此為 Index color

即是, 依照所選定

的顏色來作套色

ch3

ch4

如果是取得 series 影像, 可利用此鈕, 播放連續動態影像

slide19
Mode

功能解說

xyz

An image stack is recorded from xy-sections in z-direction. ( 最為常用的掃描模式 )

xzy

An image stack is recorded from xz-sections in y-direction.

xt

A line is recorded several successive times.

xyt

An xy-section is recorded several successive times.

xzt

An xz-section is recorded several successive times.

xyzt

An image stack is recorded from xy-sections in z-direction several successive times.

xyl

An xy-section is recorded at different wavelengths. ( 波長掃描 )

xzl

An xz-section is recorded at different wavelengths.

Mode : 影像擷取掃描模式

slide20
Single Scan / 單一影像擷取

選取 ( 可配合 Line average或 Averaging _ Frame by Frame )

slide21
3D series /

連續斷層影像擷取

決定光切數目

可配合 Averaging

以消除雜訊

每一切片的影像要

做平均處理嗎 ?

1. 連續掃描時, 調 Z-焦距, 找出最上點, 在 Begin按一下,

2. 再找出最下點, 然後在 End按一下.

3. 最後又於 連續掃描框內 ( continuous )按一下.

4. 再選切片數目, 平均數目, 按 Series 光切掃描.

slide22
The Image Tool Window

Tool selection

Dialog of the current Tool

Operation Buttons

Preview

slide23
[ 3D ] .. [ ImageTool ]

Projection & Animation 設定參考

Rotation

Rotation

Preview

快速預覽

Scaling the z-Axis

Animation

slide24
Usage (IV)

The Operation Buttons

Prev: Compute the result and show it in the Preview Window

Apply:Compute the result and transfer it into the Experiment

Close: Close the Image Tool Window

slide25
Projection & Animation

Projection & Animation Tool

Source

Parameter division

Current parameter

slide26
Projection & Animation

Maximum projection

Average projection

Transparent projection

Transparent projection (inverted z-Direction)

slide27
Projection & Animation

Rotation

z-Axis

x-Axis

y-Axis

Original

z-Rot. = 25

y-Rot. = 120

x-Rot. = 120

slide29
Projection & Animation

Stereo Effect

Near Object

Far Object

Stereo Eye Angle

slide30
Projection & Animation

Stereo Effect

Images for the left and the right eye

Stereo Image

slide31
範例 : 單一螢光影像擷取 ( FITC )
  • 玻片 : 0.17 mm
  • 浸漬油 : r =1.5180
  • Beam : L : FITC
  • Laser : AOTF 調控約至 70% 處
  • Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil
  • Mode : XYZ
  • Format : 512 x 512
  • Speed : 400 ( medium )
  • Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 )
  • Zoom : 1 ( 原廠起始設定 )
  • Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 )
  • Average : 8 ( 原廠起始設定 )
  • PMT 1 gain : 約為 700 左右
  • 顯示 : Glow ( O )
  • Overlay 顯示 : RGB
  • Continuous scan : 取得所欲觀察的聚焦面
  • 再按一次 Continuous : 停止掃描
  • 如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔.
  • 如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影像作為平均取像 )
  • 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像.
slide32
範例 : 雙重螢光影像擷取 ( FITC / TRITC)

FITC

  • 玻片 : 0.17 mm
  • 浸漬油 : r =1.5180
  • Beam : L : FITC / TRITC
  • Laser : AOTF 調控約至 70% 處
  • Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil
  • Mode : XYZ
  • Format : 512 x 512
  • Speed : 400 ( medium )
  • Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 )
  • Zoom : 1 ( 原廠起始設定 )
  • Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 )
  • Average : 8 ( 原廠起始設定 )
  • PMT 1 / 2 gain : 約為 700 左右
  • 顯示 : Glow ( O )
  • Overlay 顯示 : RGB
  • Continuous scan
  • 再按一次 Continuous : 停止掃描
  • 如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔 ( save as ..)
  • 如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影像作為平均取像 )
  • 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像.

TRITC

timelapse t mode t
Timelapse ( T ) / 長時間掃描記錄

在 Mode 選用有 “ T “ 功能的掃描模式才可執行此功能

time series 1 4
Line-Mode „xt“

Frame-Mode „xyt“

Stack-Mode „xyzt“

Time-Series 1/4
slide38
關機流程 :

請依序 1 – 7 按序關機

4

3

2

6. 結束軟體

首先按下

Scanner 鈕,

開啟掃描器

電源

1

8

5

7

注意 :

當雷射冷卻至少 15 分鐘後

再關掉 [ 8 ] 位置的電源 ( 風扇 )

1. 關掉 Ar 雷射, 往左調整

旋鈕轉到原點最小處.

關掉顯微鏡燈源 ( 汞燈, 鹵素燈 ), 擦鏡頭, 關掉實驗室總開關

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