四、微生物检验

11. 四、微生物检验 • HSV感染已有疗效显著的抗病毒治疗方法。临床上迫切需要快速准确的诊断方法。 • (一)标本采集 • 一般采集病损皮肤粘膜的拭子。新鲜水 • 疱液含有高浓度的病毒，可用棉签吸取残 • 存的水疱液后，用力擦拭病损部位的基底 • 部，以采集感染的上皮细胞。HSV能在病毒 • 运送液中存活2—3天。不得在-20℃冻存。

12. （二）标本直接检查 • 1.直接显微镜检 查用荧光素标记 • 或酶标记单克隆抗体检测HSV抗原。 • 2.核酸检测 也可采用DNA杂交或者 • PCR法直接检测标本中的HSVDNA， • 敏感性、特异性高。

13. （三）病毒分离和鉴定 • 是最为敏感的方法，并且可对HSV分离株 • 进行分型，能在许多培养细胞产生CPE。 • 常用原代人胚细胞和人二倍体细胞分离 • HSV。CPE的特点是，感染细胞肿大、变 • 圆，折光性强，有细胞融合，形成多核 • 巨细胞， CPE出现快而明显。可在接种 • 后18～24h出现CPE，病毒含量如在细胞 • 培养液中加地塞米松，可加快CPE的出 • 现，增加CPE病灶的数量。 ·

14. 通常采用特异性的MoAb进行组化染色， 可进行鉴定和分型。也可用型特异性 DNA探针进行的鉴定和分型。

15. (四)抗体检测 • 双份血清HSV抗体阳转，可诊断 • 为原发感染，但无法区分HSV型别。 • 抗HSVIgM抗体的检测无法用于区 • 分原发感染和复发感染。复发感 • 染时抗HSVIgM抗体也升高，单份 • 血清检出HSVIgG抗体表明个体曾 • 感染过HSV。 • 常用的检测方法是ELISA。

18. 微生物检验 • 临床标本主要有疱疹病损部位的 • 涂片、皮肤刮取物、水疱液、活 • 检组织和血清。主要通过病毒分 • 离、免疫荧光和原位杂交或者PCR • 等检测技术，在患者的组织或者 • 体液中证实VZV或者其成分的存在。

21. 微生物检验 • 病原学诊断方法包括直接检查、 • 病毒分离和鉴定以及血清学诊断。 • （一）直接检查 • 包括检测病毒颗粒、病毒包涵体 • 或者抗原或者核酸。

22. 1．检测病毒颗粒 可采用假复制方法 • 对HCMV先天性感染患儿的尿液和 • 口腔标本进行电镜检查，敏感性 • 为噬斑形成单位/ml，优点是快速 • 缺点是不敏感。

23. 2．检测病毒包涵体 活检组织标 本切片或者脱落细胞涂片，以 HE等常规染色，观察巨细胞以 及细胞核内嗜碱性包涵体。可 用于快速诊断，但敏感性较低。

24. 3．检测病毒抗原 活检组织标本 • 切片、脱落细胞或者周围血白 • 细胞涂片、接种标本并培养数 • 日的盖玻片细胞培养物。进行 • 免疫荧光染色，检测特异性抗 • 原。该法敏感特异快速，可用 • 于快速诊断。

25. 4．检测病毒核酸 用PCR法检测 核酸。敏感性高，能检出活 动性感染和潜伏感染。

26. (二)病毒分离和鉴定 • 是诊断最可靠的金标准。将标本接种人胚 • 成纤维细胞，观察4～6周，期间盲传2次。 • 产生特征性的CPE，细胞肿胀变圆，形成巨 • 大细胞，可作出初步诊断。经过MoAb免疫 • 染色作出最终鉴定。改良快速诊断法是培 • 养24h后用荧光素标记的MoAb直接检测表达 • 的早期抗原，在接种后24h即可检出。

27. (三)抗体检测 常用ELISA检测特异性IgG和IgM抗体。

28. (四)结果分析 • 1．先天性感染的诊断 在出生最初 • 3周内从新生儿尿液、呼吸道分泌 • 物或者其他体液分离出HCMV是最 • 敏感和特异的确诊依据。

29. 2．血清学试验结果的分析 6个月 以上的患儿，母体抗体已经消失， 如果出现双份血清抗体阳转，可 作出原发感染的诊断，可诊断为 近期感染。

30. 3．免疫功能缺损个体HCMV感染检 测结果的分析 检出HCMV提示 存在活动性感染，但不能确定 HCMV感染与疾病的相关性。

31. （五）评价 • HCMV检测结果分析必须结合患者的临 • 床评价，才能对HCMV感染和疾病提供 • 准确的诊断，及时进行对应的抗病毒 • 治疗。

33. 抗原分类 • ①潜伏期抗原，为潜伏感染细胞所 • 合成，包括EBV核抗原(EBNA)和潜 • 伏期膜蛋白(LMP)。这类抗原的表 • 达表明存在EBV基因组。

34. ②早期抗原(EA)，属于病毒非结构蛋 白，其合成不依赖于病毒DNA的复制。 EA的表达显示开始病毒复制，是增 殖标志。 ③晚期抗原(LA)，包括衣壳抗原(VCA) 和包膜抗原(MA)。

35. 微生物检验 • 病原学诊断方法包括直接检测病 • 毒抗原或者核酸、病毒分离和鉴 • 定以及抗体检测。

36. (一)直接检查 在病变组织中检测EBV抗原或者 核酸是EBV感染诊断的重要方法。 大部分病变组织中存在EBV的核蛋 白和膜蛋白等病毒产物以及EBV基 因组核酸。用核酸杂交和PCR或者 RT-PCR可检出基因组核酸及其转录 产物。

37. （二）病毒分离和鉴定 • 分离EBV的标本可以是唾液、咽漱液 • 及血细胞等，咽漱液中分离率最高， • 可达80％以上。将咽漱液接种人脐 • 带血淋巴细胞，培养4周，如果出现 • 大量的转化淋巴细胞，则提示病毒 • 培养阳性，鉴定通过免疫荧光技术 • 检测EBV核抗原。

38. (三)抗体检测 • 是最常用的诊断方法。由于不同病人 • 体内针对EBV不同的抗原成分所产生的 • 抗体的组成及水平均有一定的特征性， • 为疾病诊断提供了参考指标。

39. （四）结果分析与评价 • 根据抗体模式和滴度，可归为3大类： • ①易感：抗VCA抗体阴性； • ②原发感染：抗VCA抗体阳性，EBNA • 抗体阴性； • ③既往感染且具有免疫力：抗VCA抗 • 体和抗EBNA抗体均阳性。80％的 • EBV活动性感染的患者产生抗EA／ • D抗体。

40. 第五节人疱疹病毒6、7、8型 • 一、人疱疹病毒6型 • 感染在人群中十分普遍。少数发生 • 幼儿急疹或婴儿玫瑰疹。在器官移 • 植等患者，可发生重症感染，如脑 • 炎和肺炎等。 • 为疱疹病毒科中的一个独特成员。 • 基因组DNA为160～170kb，G+C mol • 为43％～44％。在CD4+T细胞中增殖 • 良好。

41. 微生物学检验 • 包括病毒分离和鉴定、病毒核酸检测 • 和抗体检测。 • 采集患者外周血单个核细胞，与经过 • PHA刺激的脐带血淋巴细胞共同培养。 • 出现肿大的气球样细胞提示存在病毒， • 可用免疫荧光法鉴定。 • 是HHV-6活动性感染的强有力的诊断 • 依据。

42. 采用核酸杂交技术检出HHV-6核酸。 用血清学方法检出患者血清中的特 异性IgM和IgG抗体。 从患者外周血中检出病毒或者病毒 DNA是HHV-6活动性感染的强有力的 诊断依据。

43. 二、人疱疹病毒7型 • 从慢性疲劳综合征患者的外周血单个 • 核细胞、幼儿急疹患者、肾移植患者 • 以及各种免疫抑制治疗病人中分离出 • HHV-7。在健康人的唾液中大量存在 • HHV-7。目前认为HHV-7是一种普遍存 • 在的人类疱疹病毒，但除了幼儿急疹 • 外，还没有发现其他任何疾病和HHV-7 • 存在着必然的联系。

44. 三、人疱疹病毒8型 • 是从伴发卡波济肉瘤的艾滋病患者的病灶 • 中通过分子生物学途径发现的， HHV-8具 • 有典型的疱疹病毒颗粒的形态和结构。病 • 毒dsDNA基因组为约为165kb。 • HHV-8主要感染淋巴细胞，尤其是B淋巴细 • 胞，具有嗜B细胞的特性。 • 目前认为，HHV-8是以潜伏的形式存在的一 • 种新人类肿瘤病毒。