A légúti bakteriológia nehézségei

1. A légúti bakteriológia nehézségei Mlinkó Tamás Corden Kft. Mycobacteriológiai Referencialaboratórium

2. Miért fontos terület a légúti diagnosztika? • A fertőző betegségek legnagyobb hányadát teszi ki • A járóbeteg ellátásban a legtöbb beteg légúti panaszokkal fordul orvoshoz • A kórházi eredetű fertőzések jelentős része pneumónia • A tünetek spektruma a legenyhébb náthától az életet veszélyeztető nosocomiális tüdőgyulladásig terjedhet • A legtöbb fölös antibiotikum felhasználás ezen területen történik

3. Felső légúti fertőzések sinusok gyulladásai (orrüreg, orrmelléküreg, arcüreg, homloküreg) garat és mandulák gyulladásai gégefedő gyulladása Alsólégúti fertőzések bronchitis (COPD) pneumonia (területen szerzett, nosocomiális) A légúti infekciók osztályozása

4. A diagnosztikai folyamat lépései • 1. Mintavétel • 2. Feldolgozás, identifikálás, antibiogram • 3. Értékelés, interpretálás

5. A mintavétel szabályai I. • Az egyik legfontosabb fázis, hiszen ha hibás, a további feldolgozásnak nem sok értelme van • Alapkérdések: honnan, mikor, mennyi vizsgálati anyagot vegyünk • Honnan: általában az adott anatómiai régióból, de pl. atypusos pneumóniánál szerológia hasznosabb lehet • Mikor: a kórokozó minél nagyobb mennyiségben és minél életképesebb állapotban legyen jelen: antibiotikum kezelés megkezdése előtt, hemokultúra vételénél hidegrázáskor • Mennyit: ha kevés a minta, kevesebb a benne lévő kórokozó is, és nem jut minden szükséges feldolgozási útvonalra • Az optimális minta típusát mindig az adott kórkép, a kimutatni kívánt kórokozó és a detektálási módszer együttesen határozza meg

6. A mintavétel szabályai II.Tárolás, szállítás • Törekedjünk minél hamarabb a laboratóriumba juttatni a mintát • Amennyiben 2-3 órán belül ez nem sikerül, általában hűtőszekrényben tárolható (4Cº), de ha érzékenyebb kórokozót gyanítunk (meningococcus), szobahőn tartsuk, vagy tegyük transzporttáptalajba, hemokultúra palackba

7. Kórokozók kimutatásának lehetőségei A baktériumok direkt kimutatása • Direkt kenet festése ( Gram, Ziehl-Neelsen, Neisser, fluoreszcens festés ) • Tenyésztés általános (véres agar, csokoládé agar), szelektív ( Löffler, CYE ) és differenciáló (eozin-metilénkék) táptalajokon

8. Kórokozók kimutatásának lehetőségei Baktérium valamely alkotórészének kimutatása DNS, RNS – nukleinsav hibridizáció, nukleinsav amplifikáció ( PCR ) Anyagcserevégtermékek, sejtfalalkotók – kromatográfiás módszerek Antigénkimutatás vizeletből – S. pneumoniae, Legionella pneumophila 1. szerotípus

9. Kórokozók kimutatásának lehetőségei A baktériumok indirekt kimutatása • az ellenük termelt antitestek detektálása - szerológiai módszerek (ELISA, IFA) - gamma-interferon termelés vizsgálata – IGRA (Quantiferon, T-spot)

10. A módszerek összehasonlításához két leggyakrabban használt paraméter: • Érzékenység (szenzitivitás)% = valódi pozitív minták száma / (valódi pozitív+ ál-negatív minták száma) • Fajlagosság (specificitás)% = valódi negatív minták száma / (valódi negatív+ál-pozitív minták száma)

11. Leggyakoribb légúti kórokozók csoportosítása mikrobiológiai szempontból • Könnyen és gyorsan tenyészthető baktériumok: S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, S. aureus, bélbaktériumok, P. aeruginosa, A. baumannii • Nehezen vagy nem tenyészthető baktériumok:Mycoplasma, Chlamydophila, Legionella, Corynebacterium, Bordetella, Neisseria, Nocardia, Actinomyces • Csak speciális festékkel vagy egyáltalán nem festődőbaktériumok:Mycoplasma, Chlamydophila, Legionella, Bordetella, Nocardia, Mycobacterium megoldás:különleges festékek használata, szelektív táptalajok használata, inkubálási idő növelése, szerológiai módszerek, molekuláris módszerek, antigénkimutatás

12. A feldolgozás menete • A feldolgozáshoz használt táptalajok • Általános táptalajok: a baktériumok, gombák nagy része kitenyészik rajtuk, birka-, vagy marhavért tartalmaznak, véres agar (V), csokoládé agar (CS), Schaedler agar (Sch) anaerob bakt.-hoz, gombákhoz antibiotikummal kiegészített Sabouraud agar (Sab) • Szelektív táptalajok: kiegészítő anyagok hozzáadásával bizonyos nem kívánt baktériumok növekedése gátolható (CS+ vancomycin, Uriselect) • Differenciáló táptalajok: a baktériumtelepek megkülönböztethető külsővel rendelkeznek a táptalajon-MacConkey (MAC), eozin-metilénkék (EM) Gram-negatív baktériumok esetén

13. A feldolgozás menete • A mintákból direkt kenetet készítünk és leoltjuk V, CS, EM/MAC , anaerob minták esetén CM dúsító és szilárd Sch is leoltásra kerül • Ezeken felül ha különlegesebb kórokozókra is lehet számítani vagy az orvos kéri, megfelelő szelektív táptalajokra is leoltunk, vagy az inkubálás körülményeit és idejét módosítjuk • Leoltás után a lemezeket 5-10% CO2 tartalmú termosztátban inkubáljuk másnapig, az anaerob leoltásokat anaerosztátba tesszük

14. A feldolgozás menete • A kitenyészett baktériumok közül az általunk kórokozónak tartottakat meghatározzuk és érzékenységi vizsgálatot kérünk • Az identifikálás történhet: • Hagyományos biokémiai módszerekkel kémcsőben, anyagcserevégtermékeket, szerves és szervetlen anyagok hasznosítását alapul véve • Identifikáló panelek: a panel vályulataiban liofilizált formában vannak jelen a szubsztrátumok, ezekhez kell nekünk a baktériumszuszpenziót hozzáadni, kiértékeléshez táblázatok, vagy számítógépes program

15. A feldolgozás menete • Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok • Legegyszerűbb és legolcsóbb a korongdiffúziós módszer: adott koncentrációjú antibiotikumkorongot a MH vagy V táptalajra szélesztett baktériumpázsitra helyezünk és másnap megvizsgáljuk, van-e gátlási zóna, eredmény érzékeny, mérsékleten érzékeny vagy rezisztens • Pontosabban is meghatározható egy antibiotikum minimális gátló koncentrációja (MIC) agarhígítással, leveshígítással vagy E-teszttel • Az eredményeket jelenleg az EUCAST (European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) ajánlásai alapján interpretáljuk

16. A direkt kenet jelentősége • Többféle festési eljárás • Gram-festés: a baktériumok többsége megfestődik • Ziehl-Neelsen: a saválló baktériumok kimutatására (Mycobacterium) • Immunfluoreszcens festés: Legionella • Köpetnél kettős szerepe van: • a laphámsejt és fehérvérsejt arány alapján a minőség eldöntése • Látunk-e dominánáló flórát • Segít az identifikálásban, mert a táptalajon a telepek nem feltétlenül egyértelműen felismerhetőek • Kicsi az érzékenysége, nagy mennyiségben kell hogy tartalmazza a kórokozót

17. A direkt kenet jelentősége I.Eset 1. • A véres agaron nagy csíraszámban K. pneumoniae tenyészett ki • Milyen eredményt adok ki?

18. A direkt kenet jelentősége I.Eset 1. • A kenetben csak laphámsejtek látszanak, tehát a minta feldolgozásra alkalmatlan

19. A direkt kenet jelentősége I.Eset 1. • A kenetben sok fehérvérsejt és sok Gram-negatív tokos pálca • A baktériumot identifikálom és antibiogramot kérek belőle

20. Felső légúti infekciók diagnosztikai problémái • A leggyakrabban előforduló kórkép a torok- és/vagy mandulagyulladás ( tonsillitis, pharyngitis) • Nagyrészt vírusok okozzák, a bakteriális kórokozók közül legtöbbször a Streptococcus pyogenes, de kevésbé szokványos speciesek is előfordulhatnak: Neisseria gonorrhoeae, Corynebacterium diphteriae, • Utóbbiak esetén szelektív táptalajok ( Thayer-Martin, Löffler ) használata és inkubációs idő módosítása szükséges

21. További kórképek • Középfülgyulladás (otitis media): • lehetséges kórokozók a S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, S. pyogenes, S. aureus, bélbaktériumok, krónikus esetben ezekhez társulhatnak anaerobok • Anatómiai közelsége miatt agyhártyákra is átterjedhet • Orr- és torokváladék nem alkalmas minta, tympanocentesis vagy vakuténeres mintavétel • A koponyacsont üregeinek gyulladásai (sinusitis) • Kórokozók: mint a középfülben, nosocomiális esetben Gram-negatív baktériumok is • Orrváladék nem jó minta, sinusaspirátum kell, anaerob tenyésztésre is alkalmas

22. A gégefedő gyulladása (epiglottitis) • Kisgyermekek betegsége, ritka, de veszélyes • Szinte kizárólag a H. influenzae b típusa okozza, és mivel a vérben is megjelenik, a hemokultúra releváns minta lehet • Plaut-Vincent angina • Egyoldali fekélyes folyamat, melyet Treponemák és Fusobacteriumok együttesen okoznak • A tenyésztés itt nem célravezető, mert aerob körülmények közt nem tenyésző és lassan növő baktériumokról van szó • A területről vett direkt kenet festése lehet informatív

23. A direkt kenet jelentősége Plaut-Vincent angina A kenetben Treponemák és Fusobacteriumok láthatók, melyek lassan és nehezen tenyésznének ki

24. Alsó légúti fertőzések leggyakoribb kórokozói bronchitis : nagyrészt vírusok, M.pneumoniae, C. pneumoniae, Bordetella pertussis COPD: S. pneumoniae, H. influenzae, tüdőgyulladás: közösségben szerzett:S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes, M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella pneumophila, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, M. tuberculosis nosocomiális: bélbaktériumok, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus – sokszor multirezisztensek (ESBL, MRSA, MACI)

25. Alsó légúti infekciók problémai • Leggyakoribb mintatípus a köpet • Az eredményesség javítása érdekében citológiai szűrésen megy keresztül: ha laphámsejt>10 és fehérvérsejt<10 1átótérben 100x nagyítás alatt, alkalmatlan (neutropénia!) • Sajnos szennyeződik a száj baktériumflórájával, de ha jó a minősége (fvs>25, lhs<10), és domináló baktériumflórát látunk benne, jó a specificitása, érzékenysége kevésbé magas • Kórokozó/kolonizáció probléma • Könnyen festődő és nagy csíraszámban jelenlevő baktériumok esetén jó a prediktivitása • Általános probléma, hogy a betegek egy része nem tud köpetet produkálni, ha mégis sikerül, azok 30-40%-a nem alkalmas

26. S. pneumoniae

27. S. aureus

28. Ezekben az esetekben meg lehet próbálni az eszközös mintavételt (bronchoszkópia, tűbiopszia) kvantitatív tenyésztéssael, vagy nem légúti anyagból dolgozni (vizelet, hemokultúra, szérum) • Hemokultúrát minden pneumonia esetén javasolnak, hiszen kevés a fals pozitív • A vizelet antigénteszt két kórokozó kimutatását teszi lehetővé: • A S. pneumoniae sejtfalának C-poliszacharidját és a L. pneumophila 1. szerotípusának sejtfal lipopoliszaharidját (LPS) tudja detektálni, inkább a bakterémiás pacienseknél használható • Szerológia: főleg „atypusos” kórokozóknál használatos, savópár szükséges, ezért csak retrospektív diagnózist ad

29. Atypusos kórokozók kimutatási lehetőségei • Szerológia: savópárból (akut és gyógyuló szak) IgG titeremelkedés, vagy akut IgM emelkedés - Mycoplasma, Chlamydia, Francisella, Legionella • Tenyésztés szelektív táptalajon:Francisella, Legionella, Mycobacterium, Yersinia, Nocardia • Nukleinsav amplifikáció: PCR közvetlen a mintából - Mycoplasma, Chlamydia, Legionella • Speciális festés: Legionella, Nocardia, Mycobacterium

30. Legionella antigénkimutatás vizeletből

31. Legionella • Legionella kimutatása köpetből immunfluoreszcens festék segítségével (DIF)

32. A direkt kenet jelentősége I.Eset 2. • A táptalajon 48 óra múlva sem nőtt semmi, tehát köpetként ki mehetne a negatív eredmény • A kenetben viszont Gram-pozitív gyengén festődő fonalak láthatók, ez Nocardiára vagy Actinomycesre utal • Teendő: tovább inkubálom és anaerob táptalajokra is leoltom

33. A direkt kenet jelentősége I.Eset 3. • A Gram-kenetben gyengén és szakaszosan festődő pálcák láthatók, a táptalajokon semmi nem nőtt 48 óra után • Teendő: ez Mycobacterium gyanús, ezért ZN festést kérek

34. A direkt kenet jelentősége I.Eset 3. • A ZN festés eredménye pozitív, tehát elindítom a mycobacteriológiai tenyésztést

35. Kórházban szerzett (nosocomiális) pneumoniák • A felvételt követő 3. nap után alakul ki • A kórházi fertőzések közt a második leggyakoribb ( 15-20%) és legmagasabb mortalitású • A kórokozók köre a közösségben szerzettek mellett kibővül a tipikus kórházi környezetben fellelhető baktériumokéval • Különböző rizikófaktorok befolyásolják a kórokozó jellegét: alapbetegség, antibiotikum kezelés, immunállapot, eszközös beavatkozások, katéterek, kanülök, intubálás, aktuális kórházi flóra • Leggyakrabban a lélegeztetett betegek körében fordul elő

36. Köpet vagy tracheaváladék nem optimális, nehéz eldönteni, hogy kolonizációról vagy infekcióról van szó, ezért kvantitatív tenyésztésre alkalmas mintát kell küldeni, ez növeli a szenzitivitást és specificitást • Bronchoalveoláris lavage (BAL) vagy védett kefével (PSB) vett minta ajánlott, a kórokozónak 103-104 CFU/ml csíraszámmal kitenyésző baktériumokat tekintjük • Hemokultúra vétele mindenképp ajánlott • Jellegzetesen kórházi pneumoniát okozó baktériumok: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii és ezek multirezisztens formái, multirezisztens Gram-negatív bélbaktériumok (ESBL, KPC), MRSA, egyéb Gram- negatívok-Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter sp., Burkholderia cepacia

37. Infekciók immunkárosodott betegekben A szokványostól eltérő kórokozó spektrum az immunkárosodás jellegétől függően, opportunista kórokozók is, súlyosabb és kevésbé típusos lefolyás, invazív mintavétel kvalitatív tenyésztéssel javasolt Neutropénia: S. aureus, bélbaktériumok, gombák Humorális immundefektus (leukémiák, limfómák): tokos baktériumok (S. pneumoniae, H. infuenzae, N. meningitidis) Celluláris immundefektus(HIV, immunszuppresszívkezelés): intracellulárisan szaporodó baktériumok- Salmonella, Mycobcterium, Legionella, Nocardia, Listeria, vírusok, gombák

38. Kórokozók cysticus fibrosisban (CF) • Bizonyos baktériumok preferálják és alkalmazkodnak a CF-es betegek légútaiban uralkodó környezethez (sűrű, viszkózus nyák) • Leggyakoribb a Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, H. influenzae, ritkábban Burkholderia cepacia • Nem szokványos teleptípusok, sokszor csak több nap után nőnek ki • Inkubálás idejének növelése (legalább 5 nap), szelektív táptalajok

39. A direkt kenet jelentősége I.Eset 4. • A táptalajon 48 óra után nem nőtt semmi, de a Gram-kenetben tokos G- pálcák láthatók, és a beteg cysticus fibrosis-ban szenved • Teendő: tovább inkubálom a mintát

40. A direkt kenet jelentősége I.Eset 4. • A 3. Napon megjelenik a nyálkás telepekben növő Pseudomonas, ami ezen betegekben gyakori

41. Rezisztencia problémák • S. pneumoniae: penicillin- és makrolid rezisztencia • MRSA: megjelent a közösségben szerzett infekciók között is - CA-MRSA • ESBL-termelő bélbaktériumok, karbapenemáz- termelő (KPC) bélbaktériumok, Pseudomonasok és Acinetobacterek • Csak polymixin-érzékeny Pseudomonasok és Acinetobacterek