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ゲル内タンパクの染色

ゲル内タンパクの染色. ～銀染色～. 原理. 銀イオンはアンモニア性溶液中で銀ジアミン錯体を形成する。銀イオンや銀ジアミン錯体イオンはタンパク質と結合 (-SH 基に最も結合しやすい ) し、これをクエン酸、ホルマリンの作用により還元して金属銀を析出し、ゲル内タンパク質の黒化像を得る。. [Ag ２ (NH 3 ) 2 ]+. 銀ジアミンイオン. 銀染色を用いる利点・欠点. ○ 好感度である 　　 特殊な装置は不要である 　　　ゲルを乾燥保存できる × 定量性がない 　　 非特異的である 　　 廃液中の銀イオンを処理する必要がある. 他染色との比較.

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ゲル内タンパクの染色

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Presentation Transcript

  1. ゲル内タンパクの染色 ～銀染色～

  2. 原理 銀イオンはアンモニア性溶液中で銀ジアミン錯体を形成する。銀イオンや銀ジアミン錯体イオンはタンパク質と結合(-SH基に最も結合しやすい)し、これをクエン酸、ホルマリンの作用により還元して金属銀を析出し、ゲル内タンパク質の黒化像を得る。 [Ag２(NH3)2]+ 銀ジアミンイオン

  3. 銀染色を用いる利点・欠点 ○好感度である 　　 特殊な装置は不要である 　　　ゲルを乾燥保存できる ×定量性がない 　　 非特異的である 　　 廃液中の銀イオンを処理する必要がある

  4. 他染色との比較

  5. 染色結果の比較 CBB染色 銀染色 蛍光染色 http://www.atto.co.jp/pdf/ez-silver-tech.pdf

  6. 試薬（２D-銀染色試薬Ⅱ-第一） ①固定化剤　チオ尿素 ②前処理剤　ジチオスライトール、グルタルアルデヒド、チオ尿素 ③染色液A　硝酸銀 ④染色液B　水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム ⑤現像原液　クエン酸、ホルムアルデヒド、チオ硫酸ナトリウム ⑥停止液　クエン酸

  7. 手順 ①固定液Ⅰ（10分）：メタノールと酢酸 ②固定液Ⅱ（15分） ③前処理液（10分）：グルタールアルデヒドなどによる増感 ④洗浄（5分） ⑤銀染色液（15分）：銀ジアミン錯体などがタンパクと結合 ⑥洗浄（2分×3回）：余分な銀ジアミン錯体などを洗浄 ⑦現像液（5～10分）：ホルマリンの作用で銀を析出 ⑧停止液：酸性にする ※全ての工程は振蕩しながら行う。 ※ケラチンの混入を防ぐため手袋をして操作する。

  8. 染色結果（２D-PAGE） タンパクがスポットとして染色されている

  9. 質量分析機 前処理剤（増感剤）に含まれるグルタールアルデヒドのアミノ基 を架橋する特性により質量分析前のゲル内消化の効率が悪く、 質量分析には向かない。 グルタールアルデヒドを用いていない試薬、キットを用いて染 色すると、質量分析が可能になる。

  10. 銀染色液の処理 使い終わった銀染色液は、操作完了後直ちに塩酸や塩化ナト リウムを加えて塩化銀の沈殿物にして処理します。 そのまま放置すると爆発性の銀アミドを生成する危険がありま す。

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