1 / 45

Eksperimenta metodes bioloģijā

Eksperimenta metodes bioloģijā. 9 . lekcija. 20 13 ./20 14 . mācību gada 1. semestris. Māris Lazdiņš. Proteomikas pamatmetodes. turpinājums. Masas spektrometrija. - Nosaka līdz 150 proteīniem dienā, - Automatizējami mērījumi un to interpretācija, - Jūtīga (fmol - amol).

karyn-sullivan
Download Presentation

Eksperimenta metodes bioloģijā

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Eksperimenta metodes bioloģijā 9. lekcija 2013./2014. mācību gada 1. semestris Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. Proteomikaspamatmetodes turpinājums LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. Masas spektrometrija - Nosaka līdz 150 proteīniem dienā, - Automatizējami mērījumi un to interpretācija, - Jūtīga (fmol - amol). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. Masas spektrometrija Visbiežāk izmanto peptīdu masas fingerprintu Pētāmais proteīns tiek sašķelts ar noteiktu proteolītisko enzīmu – endopeptidāzi. Parasti izmanto tripsīnu. No katra proteīna tiek iegūts vairāku peptīdu maisījums. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. Tripsīns Raksturīgs liels specifiskums šķelšanas vietu atpazīšanā. Katalizē peptīdsaites hidrolīzi aiz arginīna vai lizīna. Hidrolīze nenotiek, ja nākošā aminoskābe (R2) ir prolīns. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. Tripsīns Tripsīns (trypsin) Serīna proteāze EC 3.4.21.4 Katalizē peptīdsaišu hidrolīzi. Aizkuņģa dziedzera acīnusa šūnu (acinar cells) izdalīts enzīms, kurš veic gremošanas funkcijas divpadsmitpirkstu zarnā. Darbībai optimālie apstākļi - vāji sārmaina vide - pH8 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. Tripsīns - Salīdzinoši stabils liofilizētā veidā, - šķīdumos glabājams –80 vai –20 °C, lai novērstu autohidrolīzi, - proteolīzes reakcijās enzīmu stabilizē Ca++ jonu klātbūtne (20 mM CaCl2). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. Tripsīns Tripsīna molekulai ir Ca++ jona saistīšanas vieta, kurai pesaistīts Ca++ jons būtiski samazina enzīma autohidrolīzi. Arī dabīgajā vidē Ca++ joni regulē enzīma stabilitāti. Enzīma autohidrolīzi iespējams novērst arī ar molekulas ķīmisku modifikāciju palīdzību, piemēram, metilējot vai acetilējot enzīma molekulā esošo lizīnu sānu grupas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. Tripsīns Tripsīna autohidrolīzes produktus mēdz izmantot kā MS analīžu paraugu iekšējo masas standartu. Cilvēka tripsīns-1: 224 aminoskābes, no tām R=6; K=12 + KP=1 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. VGGYNCEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQWVVSAGHCYK 42 SR 2 IQVR 4 LGEHNIEVLEGNEQFINAAK 20 IIR 3 HPQYDR 6 K 1 TLNNDIMLIK 10 LSSR 4 AVINAR 6 VSTISLPTAPPATGTK 16 CLISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAK 32 CEASYPGK 8 ITSNMFCVGFLEGGK 15 DSCQGDSGGPVVCNGQLQGVVSWGDGCAQK 30 NKPGVYTK 8 VYNYVK 6 WIK 3 NTIAANS 7 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. Masasspektrometrija LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. Masas spektrometrija Iegūtajiem peptīdiem nosaka masu. Visplašāk tiek izmantotsMALDI-TOFMS (MatrixAssistedLaserDesorption Ionization - TimeofFlight) Peptīdus jonizē ar lāzera palīdzību. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Pielietojams samērā viegli noārdāmiem materiāliem, jo ļauj jonizēt viegli sagraujamas molekulas nekaitējot to struktūrai: - peptīdi (proteīni) - pozitīvā jonizācija [M+H+ ], - mono- / oligo-saharīdi - negatīvā jonizācija [M - H- ], - oligonukleotīdi - negatīvā jonizācija [M - H- ]. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. Masas spektrometrija MALDI - TOF MS - veiksmīgi analizējamas molekulas ar masu diapazonā no 400 - 350 000 Da, - rezultātu precizitāte: 0,1 - 0,01% no molekulas masas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Parasti izmanto slāpekļa lāzeriekārtu (=337 nm); Būtiska nozīme ir paraugu videi (matriksam, nesējam), kura: - stimulē molekulu iztvaikošanu un jonizēšanos, - saudzē paraugus no noārdīšanās lāzera starojuma ietekmē. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Prasības paraugu videi (matriksam): - neliela molekulmasa (viegli iztvaiko), - tomēr molekulmasa pietiekami liela, lai matrikss neiztvaikotu paraugu uznešanas, gatavošanas laikā, LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Prasības paraugu videi (matriksam): - skāba viela, kas kalpo par protonu donoru paraugu jonizēšanas brīdī (proteīnu/peptīdu paraugam), - labi absorbē UV starojumu (slāpekļa lāzers), - molekula ietver polāras un nepolāras daļas, lai jauktos gan ar hidrofīlām gan hidrofobām parauga molekulām un to daļām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Prasības paraugu videi (matriksam): Izvirzītajām prasībām atbilst, piemēram, 2,5-dihidrksibenzojskābe (2,5-dihydroxy benzoic acid) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Paraugu plate. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Vēsturisks atskats. Apzīmējumu MALDI 1985. gadā ieviesa zinātniekiFranz HillenkampunMichael Karasar kolēģiem. Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F. (1985). "Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules". Anal. Chem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. Masas spektrometrija MALDI- (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Vēsturisks atskats. Viņi ievēroja, ka ar pulsējošas 266 nm lāzeriekārtas palīdzību - alanīnu vieglāk jonizēt maisījumā kopā ar triptofānu, - šādā maisījumā iespējams jonizēt arī peptīdus. Triptofāns absorbēja lāzera enerģiju un palīdzēja jonizēt savienojumus, kuri šo starojumu neabsorbē. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. detektors Masas spektrometrija TOF - (TimeofFlight) MS lāzers paātrinātājs (-) + + + + + paraugu plate ar paraugu + + + + + + + + jonu reflektors spēcīgs el. lauks (+) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. Masas spektrometrija TOF - (TimeofFlight) MS - jonus paātrina spēcīgs elektriskais lauks, - tālāk tie ielido kanālā, uz kuru elektriskais lauks neiedarbojas. Sākumā jonizētie peptīdi saņem no to lādiņa atkarīgu kinētisko enerģiju, taču atšķirīgo masu dēļ tie iegūst dažādus ātrumus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. detektors Masas spektrometrija TOF - (TimeofFlight) MS lāzers paātrinātājs (-) + + + paraugu plate ar paraugu + + + + + + jonu reflektors spēcīgs el. lauks (+) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. + + + + + + Masas spektrometrija TOF - (TimeofFlight) MS lāzers paātrinātājs (-) paraugu plate ar paraugu + + + jonu reflektors - spēcīgs el. lauks (+) detektors LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. Masas spektrometrija TOF - (TimeofFlight) MS Parasti jonizēto molekulu raksturošanai izmanto mērvienību - m/z, kur m - molekulas / jona masa; z - molekulas / jona lādiņš. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. Masas spektrometrija Ar MALDI - TOF MS iegūtais proteīna profils (tripsīna autolizāts) Signāla relatīvā intensitāte (%) m/z LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. Masas spektrometrija MALDI - TOF MS MS iekārtu m/z vērtības tiek kalibrētas ar labi raksturotu peptīdu (citu molekulu) maisījumiem (marķieriem/standartiem). Šādi standarti var tikt: - analizēti kā atsevišķs paraugs (ārējā kalibrēšana), vai - var tikt pievienoti nosakāmajam paraugam (iekšējā kalibrēšana). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. Masas spektrometrija MALDI - TOF MS Rezultātu interpretāciju apgrūtina fakts, ka viena un tā paša peptīda jona masas / lādiņšvar atšķirties: - dažādi dabīgie elementu izotopi (12C / 13C utt.); - lielāks piesaistīto protonu skaits (M+2H+ ; M+3H+ utt.) - kompleksi joni ar Na+, K+, NH4+ u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. Masas spektrometrija Iegūtās masas salīdzina ar vērtībām no datu bāzes, kurā glabājas zināmo proteīnu tripsīna hidrolīzē iegūstamo fragmentu molekulmasas. (teorētiski aprēķinātas – genomiksa un transkriptomiksa dati). MALDI-TOF MS proteīnu identificēšanā nav lietojams, ja pētamā organisma genoma sekvence nav noteikta un proteīnus raksturojošo peptīdu masu datu bāze nav izveidota. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. Masas spektrometrija Ar MALDI - TOF MS iegūtais proteīna profils (tripsīna autolizāts) Signāla relatīvā intensitāte (%) m/z LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. Masas spektrometrija Ar MALDI - TOF MS iegūtais proteīna profils (m/z). 842.5100 856.5220 864.4733 870.5317 940.4754 943.4885 959.4934 970.4308 975.4785 1045.5580 1048.5716 1063.5712 1064.5892 1098.6185 1147.5876 1163.5996 1178.6280 1179.6014 1187.6316 1193.5461 1211.6607 1248.5664 1280.5561 1289.7670 1314.7019 1328.6521 1332.7121 1360.6820 1406.6617 1447.7010 1459.7311 1475.7471 1508.8107 1576.7986 1624.7649 1699.9255 1721.9134 1767.9147 1776.8961 1783.9077 1794.8293 1799.9017 1816.9798 1859.8805 2088.9872 2211.1046 2240.1851 2256.2412 2284.2079 2299.2019 2808.4450 3156.6352 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. Masas spektrometrija Bioinformātikas rīki proteīnu masas fingerprintam- Mascot http://www.matrixscience.com/search_form_select.html LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. Masas spektrometrija Bioinformātikas rīki proteīnu masas fingerprintam- Aldente http://www.expasy.org/tools/aldente/ Patreiz nav pieejams LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. Masas spektrometrija Bioinformātikas rīki proteīnu masas fingerprintam- ProteinProspector http://prospector.ucsf.edu/ LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. Masas spektrometrija Peptīdu identifikācija LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. Masas spektrometrija Hidrolīzē iegūto 4 - 10 peptīdu molekulmasu vērtības ir pietiekošs rādītājs, lai nekļūdīgi identificētu proteīnu, kura aminoskābju (mRNS, gēna) sekvence jau zināma. Taču pieaugot proteīnu sekvenču skaitam datu bāzēs, drošiem rezultātiem nepieciešams - raksturot aizvien lielāku peptīdu skaitu un - ļoti precīzi noteikt to molekulmasas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. Masas spektrometrija Tandēmā MS sniedz precīzākus rezultātus, piemēram, ESI MS / MS (ElectroSpray Ionization tandem mass spectrometry). Ar šo iekārtu nosaka ne tikai peptīdu molekulmasas, bet arī veic dažu peptīdu daļēju sekvenēšanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. Masas spektrometrija Pirmais masas analizators peptīdus sadala pēc to molekulmasas/lādiņa (m/z), pēc tam daži peptīdi tiek sagrauti ar argona molekulu palīdzību. Atkārtoti tiek noteiktas molekulmasas/lādiņa vērtības. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. Masas spektrometrija Kombinējot abu spektru datus iespējams iegūt daļēju aminoskābju secību. Tas ievērojami palielina proteīnu aprakstošās informācijas apjomu. Pēc iegūtajiem datiem var veidot DNS zondes vai praimerus, lai izdalītu un noteiktu atbilstošā gēna sekvenci. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. Darbu automatizācija Vairākas firmas piedāvā robotizētas 2D-PAAGE apstrādes stacijas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. Darbu automatizācija Nokrāsotos gelus tālāk apstrādā robotizēta sistēma. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  43. Darbu automatizācija Proteīnu paraugu vākšana no gela un apstrāde ar tripsīnu notiek automātiski. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  44. Darbu automatizācija Proteīnu paraugu vākšana no gela un apstrāde ar tripsīnu notiek automātiski. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  45. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

More Related