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第三章 分子克隆工具酶. 一 限制性内切酶 二 其他分子克隆工具酶. 在过去 20 多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在 DNA 分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为 DNA 物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的 DNA 片段并使纯化这些 DNA 片段成为可能，获得的限制性 DNA 片段可作为 DNA 操作中的基本介质。对 DNA 进行修饰的工具的出现，为重组 DNA 的实现创造了条件. 一 限制性内切酶. （一）寄主的限制与修饰现象
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第三章 分子克隆工具酶 一限制性内切酶 二其他分子克隆工具酶
在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件
一 限制性内切酶 （一）寄主的限制与修饰现象 • 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 • 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。
修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 • 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
（二）限制性核酸内切酶(restriction ednonuclease) 1.限制性核酸内切酶的概念 • 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 • 2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种特异性。
2.限制性核酸内切酶的命名原则 • 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。
限制性核酸内切酶的命名原则： 属名种名株名 Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
3.限制性核酸内切酶的分类 • 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 • Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。
5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作 ◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： • Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 • MgCl2 10mmol/L • NaCl 0-100mmol/L • DTT 1mmol/L • Volume 20-100μL • Temperature 37℃ • Time 1-1.5h ◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。
6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。 ②建立DNA分子的限制酶图谱。 ③构建基因文库。 ④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。 ⑤改建质粒。
7.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(star activity) • 在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。
星活性产生的原因如下： ①反应体系中甘油的浓度大于5%。 ②酶用量过大，大于100U/微克DNA。 ③低离子强度，小于25mmol/L。 ④高pH，大于8.0。 ⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。 ⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价 离子的存在。 • 常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。
8.影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： • 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 • 加大反应总体积 • 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度 • 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等，但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。 • 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。 • 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。
③ 酶切反应的温度 • 多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或30℃ ，SfiI为50℃ 。 • 反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。 ④DNA分子结构 某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。
⑤核酸内切酶的缓冲液 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。
9.Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 ①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。 ②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。 ③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。 ④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
10.同裂酶与同尾酶、同位酶 • 同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 • 同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。 • 同位酶：不同来源的限制性核酸内切酶识别相同的的核苷酸序列，但切割位点不同，这类酶称为同位酶。
11.位点偏爱 某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱。 某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。λ噬菌体DNA为48502bp，两端为12bp粘性末端。EcoRⅠ酶切割λ噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；EcoRⅠ对腺病毒2DNA不同位置切点的切割速率也不同。
本节重点掌握的内容 • 限制性核酸内切酶的定义、性质和结构。 • 产生星活性的原因、影响酶活性的因素。 作 业 • 限制性内切酶可划分为哪几个类型，各有何特点？ • 总结影响酶活性的因素。
二 其他分子克隆工具酶 （一）DNA聚合酶(DNA polymerase)
2.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) （1）Klenow酶的基本性质： • 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。 • Klenow酶仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶活性。
（2）Klenow酶的基本用途： • 补平由核酸内切酶产生的3′粘性凹出末端 • 抹平DNA的3′粘性凸出末端 • DNA片段的同位素末端标记 • cDNA第二链的合成 • 双脱氧末端终止法测定DNA序列
3.T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase) （1）T4 DNA酶的基本特性： • 有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性。 • 在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切 －在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。 －在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
4.反转录酶(reverse transcriptase) 反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′→5′和5′→3′的RNA外切核酸酶活性。AMV和MLV。
（二）DNA连接酶(DNA ligase) • DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。
1、T4 DNA连接酶的作用机制： ①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。 ②E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶。 ③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′－磷酸二酯键，并释放出AMP。
2、DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L ATP 0.5-1mmol/L DTT 5mmol/L Volume 10-20μL Temperature 4-15℃ Time 4-16h
3、平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。 提高平头末端连接效率的方法包括： • 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。 • 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。 • 加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。 • 加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200 mmol/L。
（三）核酸修饰酶1.碱性磷酸酶(alkaline phosphatse)
