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xiap 原核重组蛋白的表达和纯化

xiap 原核重组蛋白的表达和纯化. 报告人：周光现. 日期： 09-06-01. 简介 材料和方法 结果 讨论. 简介. X 连锁凋亡抑制蛋白（ X-linked inhibitor of apoptosis protein ， XIAP ）是一类细胞内源性凋亡抑制蛋白，它特异性的抑制 caspase 活性，通过多种途径抑制细胞凋亡。可以作为肿瘤检测的一个指标也可以作为治疗和预防肿瘤的一个靶标。 可以作为肿瘤检测的一个指标也可以作为治疗和预防肿瘤的一个靶标。 本文通过 pET151-XIAP 载体在大肠杆菌中表达， Ni-NTA 亲和层析柱纯化。

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Presentation Transcript

  1. xiap原核重组蛋白的表达和纯化 报告人：周光现 日期：09-06-01

  2. 简介 • 材料和方法 • 结果 • 讨论

  3. 简介 • X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是一类细胞内源性凋亡抑制蛋白，它特异性的抑制caspase活性，通过多种途径抑制细胞凋亡。可以作为肿瘤检测的一个指标也可以作为治疗和预防肿瘤的一个靶标。可以作为肿瘤检测的一个指标也可以作为治疗和预防肿瘤的一个靶标。 • 本文通过pET151-XIAP载体在大肠杆菌中表达，Ni-NTA亲和层析柱纯化。 • 表达和纯化优化（初始OD600 0.6、温度30、IPTG浓度0.5ug/ml、诱导时间4h时）。 • 纯化过程中，增加两个不同pH的洗脱液（pH 5.4、pH 4.9）。

  4. XIAP结构和功能示意图

  5. 材料和方法 • 材料 试验用质粒pET151-XIAP、菌种JMY109、Rosseta为实验室保存 主要试剂 诱导培养：LB培养基、氨苄、异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG） 蛋白纯化：尿素、Tris、NaH2PO4 SDS-PAGE电泳：30%丙烯酰胺、1.5mol/L Tris(pH8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵 、TEMED 、1mol/L Tris(pH6.8)

  6. 原核载体构建（pET151） 转化Rossate 小型诱导 诱导温度 诱导时间 IPTG浓度 在最佳诱导条件下大型诱导（200ml） 细胞破碎 蛋白纯化 蛋白纯化条件优化 SDS-PAGE检测 实验技术路线图

  7. pET151原核载体构建 • 表达载体转化 1.感受态细胞制备（CaCl2） 2.转化 • 诱导条件优化（IPTG浓度、时间、OD、诱导温度） • 蛋白纯化条件优化 1.Ni-NTA柱标准方法洗脱 2.透析

  8. 结果：一、表达优化 1.初始OD值的影响

  9. 从图中可以看出，当OD为0.6时，目的蛋白表达最多。而且随着OD值的继续增大，蛋白表达量有下降，但是不明显。说明在温度37℃，IPTG浓度5ug/ml，诱导时间4h的情况下，诱导前的OD值在0.6-1.0范围内时，目的蛋白表达量都较高。

  10. 2.诱导温度

  11. OD值为0.6,IPTG浓度为IPTG浓度5ug/ml，诱导时间4h的情况下，30℃诱导的结果明显好于其他温度，遗憾的是目的蛋白始终在沉淀中，没有成为可溶性蛋白，即使是在低温下诱导。

  12. 3. IPTG浓度

  13. 温度30℃，初始OD600 0.6，诱导时间4h的情况下。IPTG浓度低于0.5ug/ml是目的蛋白表达量较少，而高于0.5ug/ml时，目的蛋白表达量高，而且随着IPTG浓度的增大，对目的蛋白表达量的影响不大。可以初步确定IPTG浓度为0.5ug/ml是较为经济和高效的诱导浓度。同样目的蛋白仍然存在于沉淀中。

  14. 4.诱导时间

  15. 温度30℃，初始OD600 0.6，IPTG浓度0.5ug/ml时，设计不同的诱导时间梯度可以看出，诱导时间在4-8h时，目的蛋白表达较高，而且差异不大。当诱导时间达到10h时，蛋白表达量下降。这可能是由于菌种中某种酶降解该蛋白的缘故。 总结： 通过以上4个实验，可以初步确定，温度30℃，初始OD600 0.6，IPTG浓度0.5ug/ml，诱导时间4h,是诱导XIAP原核重组蛋白表达的最经济最有效地条件。

  16. 二、蛋白纯化条件优化 Ni-NTA柱标准方法洗脱跑胶检测 M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH

  17. Ni-NTA柱改进方法洗脱后SDS-PAGE胶检测 M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH

  18. Ni-NTA柱改进方法洗脱后SDS-PAGE胶检测（增加了两个PH）Ni-NTA柱改进方法洗脱后SDS-PAGE胶检测（增加了两个PH） M：Marker A：蛋白原液B：穿透液W：清洗液5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH 5.4、4.9洗脱液pH

  19. 总结：在增加两个不同pH洗脱液后，发现在洗脱液pH为4.9、4.5时洗脱下来的目的蛋白较标准方法多。但是纯化后的蛋白依然有两条杂带，这有一条可能是His标签蛋白，另外有可能是由于与目的蛋白等电点很接近，没法用不同梯度的pH将其分离。

  20. 讨论： 1.原核表达操作简单、生长周期短，能在短时间内表达大量目的蛋白。但不能进行内含子的自我剪接，表达的蛋白质不能进行翻译后加工，不能进行正确折叠，使表达产物量少，活性低。 2.原核表达中应该注意的事项：（1）选择合适的载体 （2）选择合适的菌种（3）选择标签（4）选择合适的诱导条件 3.怎样提高可溶蛋白的含量 4.原核生物表达的外源蛋白纯化

  21. 结论： • 1. 原核重组蛋白的最佳诱导条件为：初始OD600 0.6、温度30、IPTG浓度0.5ug/ml、诱导时间4h。 • 2. 在纯化过程中，增加两个不同pH的洗脱液，可以显著增加纯化后目的蛋白的含量。

  22. Thanks！

  23. Caspases • 存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。 • 能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。

  24. Caspases • 现已确定至少存在11种caspase： 这些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能还有caspase 4被认为不直接参与凋亡信号的转导，它们主要参与白介素前体的活化；而caspase 2，caspase 8，caspase 9和caspase 10参与细胞凋亡的起始；参与细胞凋亡执行的则是caspase 3，caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制剂特异性，它们降解PARP，DFF-45（DNA fragmentation factor-45），导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。而caspase-6的底物是lamin A和keratin 18，它们的降解导致核纤层和细胞骨架的崩解。 • 　　细胞中合成的caspase以无活性的酶原状态存在，以后经活化方能执行其功能。

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