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フローサイトメトリーの特徴

フローサイトメトリーの特徴. 細胞の個々の大きさと形態の情報，および蛍光染色した DNA/RNA や蛍光抗体で染色したタンパク等の情報を迅速かつ高感度に測定する方法． 1960 年代後半に開発された． 蛍光を測定する標準的な方法の蛍光顕微鏡に比べて下記のような特徴がある． 　・短時間に多くの細胞を生きたまま客観的に測定できる（リアルタイム・高速性・定量性） 　・微弱な蛍光を測定できる（高感度） 　・人為的要因による結果のバラツキが少ない（高再現性） 　・１回の測定で多くの情報を取得できる（マルチパラメータ解析・クラスター解析）

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フローサイトメトリーの特徴

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Presentation Transcript

  1. フローサイトメトリーの特徴 • 細胞の個々の大きさと形態の情報，および蛍光染色したDNA/RNAや蛍光抗体で染色したタンパク等の情報を迅速かつ高感度に測定する方法． • 1960年代後半に開発された． • 蛍光を測定する標準的な方法の蛍光顕微鏡に比べて下記のような特徴がある． 　・短時間に多くの細胞を生きたまま客観的に測定できる（リアルタイム・高速性・定量性） 　・微弱な蛍光を測定できる（高感度） 　・人為的要因による結果のバラツキが少ない（高再現性） 　・１回の測定で多くの情報を取得できる（マルチパラメータ解析・クラスター解析） 　・特定の細胞の高速分取が出来る（ソーティング）

  2. 超高速セルソーターMoFlo セルソーター：細胞を蛍光物質で標識し，高速で流しながら解析・分取する装置 製造：Dako (Denmark)

  3. 側方散乱光、各種蛍光、ミラーで分光 前方散乱光 検出器 ノズル レーザー光、 (3波長同時励起可能) ドロップディレイ 液滴への チャージ 液滴形成点 水平電場 形成電極板 + - + 廃液受け + - + - ソーティングサンプル受け （4種同時に分離可能) ソーティングの原理 最大３つのレーザーを搭載でき，最大10種類の蛍光を同時測定可能．

  4. Nozzle tip in view Pinholes Stream Optics専用のCCDカメラを見ながら光軸調整できる CytoNozzle Stage FSC Detector Stage Pinhole Strip Fixed Focal distance Fixed Side Scatter Collection Objective Laser Focus Stage

  5. 専用のCCDカメラを見ながら光軸調整できる • 従来，光軸調整がやっかい．オシロスコープによる調整が必要． • 光軸調整不要の機種もある．主要回路のブラックボックス化． Nozzle tip in view Pinholes Stream

  6. 60khz MoFLo 100khz High Speed Sorting 液滴が小さく、多いことで高速でも超高速分離可能 30khz 40,000 events/sec 0.0001 sec

  7. MoFloの特長 • 超高速の信号処理（特許） • 特許Nozzle（高圧でも細胞にダメージを与えない） • High power • 光軸調整が容易 • 高い回収率・純度 • 高速ソーティングに最も適している(最速70,000/sec) • SP解析、分離精度が高い • 解析しやすい

  8. ソーターの比較

  9. 造血幹細胞 × × ○ Side Population (SP) cell Hoechst 33342によるマウス骨髄単核細胞染色 Hoechst-Red (585/42) S-G2M G0/G1 Hoechst-Blue (424/44) Goodell et al J Exp Med. 1996;183:1797.

  10. SP細胞の特徴 • SP細胞は種を越えて存在する. Goodell MA et al. Nat Med.1997;3:1337. • SP細胞はさまざまな組織に存在する． • SP細胞は，ABCトランスポーターを介して色素を細胞外に排出する． Zhou S et al. Nat Med. 2001;7:1028. • 心筋梗塞後にSP細胞由来の心筋再生が起こる．Jackson KA et al. J Clin Invest. 2001;107:1395.

  11. MoFloを用いたマウスSP細胞のSorting マウス（B6／8週齢）の骨髄より分離した単核球分画を、Hoechst染色後、 MoFloを用いてSP細胞の分取を行った。 Sorting前 Sorting後 マウス骨髄単核球分画 分取細胞の解析結果 0.17% 0.29% 98.25% 結果：純度 98% のマウスのSP細胞分画が分取できた。 再生医学研究部

  12. 0.5% 2.8% Ho-Blue Ho-Red マウス各組織のSP細胞 Brain Liver Kidney Pancreas 0.8% 0.3% 0.7% 0.44% Muscle Heart 慶応大学松崎有実ら

  13. MoFloのまとめ • さまざまな動物種の各組織に存在する幹細胞の解析や単離を可能にする． 多くの講座の研究の発展に寄与する． 15講座の申請，共用機器室に設置． • 細胞を超高速で処理できる． サル・ブタのような大型動物を用いた細胞移　植実験にも対応可能．

  14. セルソーターについて注意事項 • 使いやすくなってきたが，依然トラブルの多い，手のかかる装置である． • 最近のフローサイトメーターは８カラー以上の解析が可能になった（最大１８）．その際にはコンペンセーションなど，多重解析の原理を理解することが大切． • 今後はソーティング機能をぜひ役立てていただきたい．細胞を生きたまま分離して解析できるのがフローサイトメーターの最大の長所だから．

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