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第九节 分子直接进化技术

第九节 分子直接进化技术. 生物的自然进化. 进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 进化结果： 基因多样性 ：为完成同一功能所表现出的 ----- 多个基因或同一个基因（同源性） 代谢途径的多样性 ：同样产物，多条途径（如木糖 木酮糖） 代谢产物的多样性 ：同一底物，不同产物 生物多样性. 分子进化工程的种类. 获取新基因的方法. 常规的基因工程方法 已知的生物、基因和功能 新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计 基因的直接进化（ directed evolution) 可使已有基因获得新的特性

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第九节 分子直接进化技术

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Presentation Transcript

  1. 第九节分子直接进化技术

  2. 生物的自然进化 • 进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 • 进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的-----多个基因或同一个基因（同源性） 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（如木糖 木酮糖） 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性

  3. 分子进化工程的种类

  4. 获取新基因的方法 • 常规的基因工程方法 已知的生物、基因和功能 • 新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计 • 基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题

  5. 基因直接进化的用途 • 改变酶的特性----多功能或单功能酶 • 提高酶活性---天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍 • 改变底物特异性和对映异构体选择性----酯酶可水解非天然酯类 • 改变酶的工艺性----冷适应和热适应酶 • 改善酶的稳定性----二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶 • 获取许多新的理论知识

  6. TLPs 的失活曲线

  7. TLP-ste突变蛋白的三维结构

  8. 酶拓扑结构的变化

  9. 蛋白质的耐热机制 • 天然耐热蛋白质特性： 减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积/体积比；除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去-支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。 所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不超过75%。 • 分子进化耐热蛋白质特性： 邻-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突变体8g8的了稳定性提高了17C，但突变的氨基酸数仅有13个，与天然酯酶同源性高达97%。

  10. 基因直接进化的步骤 • 突变 基因突变库的建立 • 筛选 基因突变库的活体或离体筛选 • 基因复制与遗传

  11. 建立基因突变库的方法 • PCR方法 1）易错PCR法 2）随机引物延伸法 • DNA重组装（DNA Shuffling)方法 1）外显子、单基因和基因家族的重组装 2）随机多重组PCR法(RM-PCR) • 随机片段活体突变法 线状基因和随机片段共转化酵母细胞

  12. 易错PCR方法

  13. Random-priming recombination(RPR) 随机引物重组法

  14. 随机挑取枯草杆菌蛋白酶 RPR库中10个克隆序列

  15. DNA重组装原理图 (DNA shuffling) • 1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； • 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段

  16. 随机挑取枯草杆菌蛋白酶DNA 重组装库中10个克隆序列

  17. Table 1 Frequency of active clones obtained after DNA shuffling under different conditions a As suggested in ref. 7. b Clones exhibiting >10% wild-type subtilisin E activity.

  18. DNA重组装过程

  19. 多重组和随机多重组PCR原理图

  20. RM-PCR法构建 随机重组装库(A)和剪接库(B)

  21. 基因突变库的筛选方法 • 活体筛选法 遗传互补筛选法 • 活体---离体筛选法 噬菌体显示法；细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面） • 离体筛选法 1）核糖体显示技术 2）RNA-蛋白质融合技术(RNA显示技术）

  22. 丝状噬菌体的生活周期

  23. 噬菌体显示筛选模式

  24. 噬菌体显示的几种类型

  25. M13噬菌体pIII和pVIII的显示

  26. 核糖体显示技术

  27. RNA-蛋白质融合技术

  28. RNA-蛋白质的融合

  29. 寡霉素与核苷酸的连接

  30. Myc ds-DNA的富集

  31. 谢谢大家！

  32. 交错延伸PCR突变法

  33. 质粒肽库的设计和筛选 （引自Schatz等，1996）

  34. 抗体库的构建和筛选

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