S usceptibilitatea bacteriei Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. la uleiul volatil din pericarp ul de Citrus

1. Susceptibilitatea bacteriei Erwiniaamylovora (Burrill) Winslow et al. la uleiul volatil din pericarpul de Citrusmaxima Osbeck Crina Saviuc, LuminițaMăruțescu, MarcelaBucur, BogdanSavu, Mariana CarmenChifiriuc, ElizaOprea, Tatiana EugeniaȘesan, VeronicaLazăr Universitatea din București Facultatea de Biologie

2. Introducere „Nu există o boală a pomilor fructiferi mai distructivă ca „foculbacterian” al rozaceelor” (M.B. Waite, 1895). “Focul bacterian” al rozaceelor este cea mai păgubitoare boală a speciilor pomicole seminţioase, a căror producţie se bazează pe întreaga durată de viaţă (15-20 ani), patogenul putând distruge un pom în numai 6 luni de la infecţie (Vlad, 2003).

3. Introducere Simptomele de „foc bacterian” sunt uşor de diferenţiat. Există cinci stadii ale bolii: arsura inflorescenţelor, arsura lăstarilor, ulcere, arsura altoiului, arsuri asociate leziunilor produse în mod natural (Naqvi, 2004). Probe de Malus sp. (A) și Pyrus sp. (B) cu simptome de „foc bacterian”: arsura şi cȃrja caracteristică a lăstarilor. A – joncţine ţesut vegetal sănătos – ţesut necrozat. (Luminita Marutescu. “Caracterizarea fenotipică şi genotipică aplicată în taxonomia unor tulpini de Erwinia amylovora, agentul etiologic al focului bacterian al rozaceelor” (teza de doctorat). 2010.)

4. Introducere • Ȋn România • „Focul bacterian” al rozaceelor a fost semnalat pentru prima dată, în anul 1992, în două localități diferite: Brăila și Mărăcineni- Argeș (Severin 1996). • Boala a avut o evoluţie rapidă, astfel că în 1993 a fost semnalată în alte 19 localităţi din 9 judeţe (Constantinescu şi colab., 1994) • În anul 1994 a fost depistată în alte 5 judeţe (Severin și colab., 1999). • În 1995 în18 judeţe (Severin şi colab., 1999). • În 1996 a fost raportată în 23 de judeţe (Severin şi colab., 1999). • În anul 1998 a fost depistată în 37 de judeţe. • În anul 2000 în toate judeţele ţării (Vlad, 2003).

5. Introducere Erwinia amylovora organism de carantină fitosanitară Agentul etiologic al bolii „focul bacterian al rozaceelor”, E. amylovora este un organism de carantină reglementat (Directiva Uniunii Europene nr. 2000/29 EC; în România prin: Ordinul MADR nr. 28/1993, Ordonanţa de Guvern nr. 136/2000, HG. nr. 1135/2004, HG. nr. 563/2007, Ordinul MADR nr. 583/2007 şi Ordinul MADR nr. 61/2008). E. amylovora produce boala „focul bacterian” la arbori şi arbuşti din familia Rosaceae, având un spectru larg de plante-gazdă în interiorul familiei. Familia Rosaceae prezintă o importanţă economică deosebită. Cele mai importante specii, atât din punct de vedere economic cât şi epidemiologic, sunt: Amelanchier alnifolia, A. canadensis, Chaenomeles sp., Cotoneaster sp., Crataegus sp., Cydonia oblonga, Malussp., Eriobotrya japonica, Mespilus germanica, Pyracantha sp., Pyrussp., Pyrus amygdaliformis, Sorbus sp., Stranvasia davidiana.

6. Introducere • Un control eficient al bolilor la plante presupune integrarea unor metode variate de protecţie (agrofitotehnice, chimice şi biologice), eliminarea sursei de infecţie (tăieri, arderi) precum şi creşterea rezistenţei plantelor la infecţie (Mikiciński şi colab., 2008). • În ultimele două decenii, metodele biologice de control au evoluat de la studii fundamentale la o componentă a strategiilor de control integrate (Jonhson şi Stockwell, 2000). • Metode agrofitotehnice: • măsuri de carantină • utilizare de material de plantare certificat • măsuri sanitare • măsuri de fertilizare şi cultivare • tăieri • sisteme de prognoză a “focului bacterian” al rozaceelor • Metode chimice: • compuşi pe bază de cupru • antibiotice • Metode biologice: • tulpini microbiene cu activitate antibacteriană faţă de E. amylovora • extracte vegetale ș.a.

7. Scop și obiective Scop: Studiul sensibilității bacteriei Erwiniaamylovora (Burrill) Winslow et al. la uleiul volatil din pericarpul de Citrusmaxima Osbeck. • Obiective: • Extracția și caracterizarea uleiului esențial din pericarp de Citrus maxima • Determinarea calitativă a sensibilității bacteriei Erwinia amylovora la uleiul volatil din pericarp de Citrus maxima • Evaluarea cantitativă a capacităţii de inhibiţie a uleiului volatil asupra aderenţei tulpinilor bacterienela suprafaţa diferitelor fragmente de frunze de Pomoideae • Evidenţierea cu ajutorul microscopiei confocale a capacităţii de inhibiţie a aderenţei microbiene de către uleiul de • C. maxima

8. Materiale și metode 1. Extracția și caracterizarea uleiului esențial din pericarp de Citrus maxima 1.A Extracția uleiului volatil • Material vegetal- pericarp de C. maxima uscat sau proaspăt • Instalație de obținere a uleiurilor volatile Neo- Clevenger Metoda: Extracție continuă Principiul metodei: antrenarea cu vapori 1.B Caracterizarea uleiului volatil • Soluția stoc de ulei volatil • Cromatograf de gaze Fisons InstrumentsGC8000, cuplat cu spectrometru de masă cu ionizare prin impact și analizor quadrupol Metoda: cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă Principiul metodei: eluarea gradată a compușilor din coloană identificarea comparativă a compușilor

9. 2. Determinarea calitativă a sensibilității bacteriei Erwinia amylovora la uleiul volatil din pericarp de Citrus maxima Materiale: • Mediu LB turnat în plăci Petri (grosime 3-4mm, pH 7.2) • Inocul suspensie bacteriană 0.5 McFarland (1.5x108) • Soluție stoc ulei volatil Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer Principiul metodei: corelarea creșterii bacteriene cu difuzia substanței de cercetat în mediul de cultură Două tulpini de E. amylovora au fost utilizate pentru evaluarea activităţii antimicrobiene a uleiului esențial de C. maxima. Ea35 Ramuri cu frunze - Malus sp. 2005 Mehedinţi Ea36 Ramuri cu frunze - Malus sp. 2005 Mureş

10. Materialul vegetal utilizat pentru studiul influenţei uleiului de pomelo asupra capacităţii de aderenţă a tulpinilor de E. amylovora 3. Evaluarea cantitativă a capacităţii de inhibiţie a uleiului de pomelo asupra aderenţei tulpinilor bacterienela suprafaţa diferitelor fragmente de frunze de Pomoideae • fragmente de frunze; • inoculsuspensie bacteriană 0.5 McFarland (1.5x108 UFC/mL) • soluție stoc ulei volatil • Metoda diluțiilor adaptată: • - pretratament cu ulei volatil al fragmentelor de frunze în cinci variante de lucru (1,2,3,5,10min.); • colonizarea bacteriană; • - studiu comparativ UFC/mL între martorii pozitivi și probele pretratate.

11. 4. Evidenţierea cu ajutorul microscopiei confocale a capacităţii de inhibiţie a aderenţei microbiene de către uleiul de pomelo • microscop CSLM TGS-SP Leica dotat cu PL FLUOTAR si un laser Ar-Fe reglat la 488nm • fragmente de frunze colonizate cu E. amylovora: frunze pretratate cu ulei volatil, martor pozitiv • martor negativ frunze imersate în AFS • S-a obţinut o rezoluţie laterală de 200 nm. • Software-ul Leica s-a utilizat pentru examinarea topografiei suprafeţei şi pentru analiză statistică. • CSLM se bazează pe principiul eliminarii luminii directe din planurile din afara focalizării prin intermediul unor aperturi confocale. • Analiza topografiei este posibilă prin înregistrarea unor serii de imagini pe axa z.

12. Rezultate și discuții • Soluţia stoc de ulei volatil s-a obţinut după practicarea a 6 extracţii. • Concentraţia medie de ulei (mL ulei/100g material vegetal uscat) fiind de 0.87% pentru materialul vegetal uscat, iar pentru materialul vegetal proaspăt (mL ulei/ 100g material vegetal proaspăt), de 0.37%.

13. Ilustrarea activităţii antimicrobiene a uleiului de pomelo faţă de tulpina E. amylovora Ea36. Rezultate și discuții • Investigarea proprietăţilor antimicrobiene ale uleiului de pomelo a arătat că acesta manifestă un efect inhibitor asupra: • creşterii microbiene; • capacităţii de aderenţă a celulelor de E. amylovora la suprafaţa frunzei.

14. Rezultate și discuții • Investigarea proprietăţilor antimicrobiene ale uleiului de pomelo a arătat că acesta manifestă un efect inhibitor asupra: • creşterii microbiene; • capacităţii de aderenţă a celulelor de E. amylovora la suprafaţa frunzei. • Analizele cantitative ale efectului inhibitor manifestat de uleiul de pomelo asupra aderenţei au arătat că acest efect inhibitor este dependent de: • timp; • planta gazdă.

15. Rezultate și discuții Reprezentarea grafică a influenței uleiului de pomelo asupra aderenței tulpinilor de E. amylovora la suprafața frunzei

16. Microscopia confocală a confirmat rezultatele determinărilor cantitative ale influenţei uleiului de pomelo asupra aderenţei microbiene, neevidenţiind la suprafaţa frunzei supusă tratamentului timp de 5 minute cu ulei de pomelo, celule bacteriene de E. amylovoraaderate. Rezultate și discuții

17. Rezultate și discuții C • Evidențierea cu ajutorul CSLM a efectului de inhibiție exercitat de uleiul de pomelo asupra aderenței bacteriene: • Martor negativ (fragment de frunză de Cydonia sp. imersat ȋn apă distilată sterilă) • Martor pozitiv (fragment de frunză de Cydonia sp. imersat ȋn suspensie bacteriană de E. amylovora Ea7) • Fragment de frunză de Cydonia sp. tratat timp 5 minute şi apoi imersat pentru 2 ore ȋn suspensie de E. amylovora. • Microscopia confocală a evidenţiat în cazul fragmentelor de frunze martor pozitiv (netratate cu ulei) celule bacteriene aderate la suprafaţa frunzei în timp ce pe suprafaţa frunzelor tratate cu ulei de pomelo nu au fost evidenţiate celule bacteriene de E. amylovora.

18. Concluzii • Investigarea proprietăţilor antimicrobiene ale uleiului de pomelo a arătat că acesta manifestă un efect inhibitor atât asupra creşterii microbiene cât şi asupra capacităţii de aderenţă a celulelor de E. amylovora la suprafaţa frunzei. • Rezultatele preliminare referitoare la activitatea antimicrobiană a uleiului de pomelo recomandă acest extract vegetal pentru continuarea cercetărilor în vederea obținerii unui nou mijloc de biocontrol, pentru strategiile alternative de combatere a focului bacterian al rozaceelor la pomii fructiferi.

19. Vă mulțumesc! • Bibliografie selectivă: • Johnson K.B. and Stockwell V.O. Biological Control of Fire Blight. In Vanneste J.L. • (Ed). Fire blight: the Disease and its Causative Agent, Erwinia amylovora. 2000. • CABI Publishing Wallingford. Pages 319-337. • Marutescu L. “Caracterizarea fenotipică şi genotipică aplicatăîn taxonomia unor tulpini de Erwinia amylovora, agentul etiologic al focului bacterian al rozaceelor” (teza de doctorat). 2010 • Mikiciński P., Sobiczewski S. and Berczyński S. Selection of bacteria from epiphytic populationson apple trees and soil environment for ability to control fire blight (Erwinia amylovora) Phytopathol.Pol. • 2008. 47: 43–55. • Naqui S.A.M.H. Diseases of fruits and vegetables: diagnosis and management. Springer, 2004. 66-82. • Stanciu Gh., Savu B.,Hristu R.CLSM – Application in the investigation of microbial biofilms. Workshop Medical significance of microbial biofilms. 2008. • Vanneste J.L. Inhibition of Erwinia amylovora and Potential Antagonistic Bacteria by Essential Oils and Natural Compounds. Proc. 9th Int. Workshop on Fire Blight. Eds. C. Hale and R. Mitchell. • Acta Hortic. 2002.590. • Vlad F. Epidemiologia si prevenirea focului bacterian al rozaceelor (Erwinia amylovora). • (teza de doctorat). 2003.