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Presentation Transcript
slide1

A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria

Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S. Trinidad, J. M. Silverman, B. B. Ohlson, K. G. Hicks, R. L. Plemel, M. Li, S. Schwarz, W. Y. Wang, A. J. Merz, D. R. Goodlett and Joseph D. Mougous

Publié en janvier 2010

Hadj-Saïd Jessica

slide2

Pseudomonas aeruginosa

G -

Pathogène opportuniste à large spectre d’hôtes

Infections aiguës

Infections chroniques

patients brulés

patients immunodéprimés

mucoviscidose

Système de sécrétion de type VI

(Potvin et al. 2009)

slide3

HcpSecretion Island-I (II ou III) encoded type VI secretion system

HSI-I : pathogénicité de P.aeruginosa (Potvin et al. 2009;Morgous et al. 2006)

slide4

Système de sécrétion de type VI

phosphoryle

Fha1-Ƥ

PpkA-Ƥ

trimère perforation des membranes bactériennes

gp5 gp27 (queue du bactériophage)

hexamère

nanotubes (Ballister, Mougous 2008)

H1-SST6 activé

déphosphoryle

Fha1

H1-SST6 inactivé

PppA

HCP: HémolysinCoregulatedProtein

VgrG: Valine glycine rich G

P

(Leiman et al. 2009)

(Filloux et al. 2008)

slide5

Objectifs

Trouver de nouvelles protéines sécrétées par le H1-T6SS

Comparer le sécrétome

H1-T6SS fonctionnel (état ouvert)

H1-T6SS non fonctionnel (état fermé)

Et de les étudier (pathogénicité, cible)

slide6

Comment caractériser l’état ouvert et l’état fermé de H1-T6SS?

vsv-g

hcp1

Western Blot révélant Hcp1-V

Fusion traductionnelle:

P

∆pppAa le H1-T6SS actif (état ON)

∆clpV1 ale H1-T6SS inactif (état OFF)

slide7

Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa

∆pppA

∆clpV1

H1-T6SS

ON

H1-T6SS

OFF

Sécrétomes

Spectrométrie de masse

Tse1

VgrG1

Tse2

VgrG4

Tse3

slide8

Deux protéines VgrG sont sécrétées par H1-T6SS

OFF

ON

vsv-g

vgrG

Western Blot révélant VgrG1-V et VgrG4-V

Fusion traductionnelle:

OFF

ON

VgrG sont bien exportées par H1-T6SS

Pour une raison inconnue on a plusieurs formes de VgrG4

slide9

Trois protéines Tse1, Tse2, et Tse3 sont sécrétées par H1-T6SS

tse

vsv-g

Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V

Fusion traductionnelle:

OFF

OFF

OFF

ON

ON

ON

Tse1-3: pas de sécrétion sans Hcp (composants)

Tse1-3 sont bien exportées par H1-T6SS

slide10

Tse1-3 et VgrG: substrats ou composants du H1-T6SS ?

OFF

ON

Western Blot révélant Hcp1-V

Sécrétion de Hcp en absence de Tse1-3

Pas de sécrétion de Hcp en absence de VgrG

Tse1-3 sont des substrats

VgrG1 et VgrG4 sont des composants du H1-T6SS

slide11

La voie Gac/Rsm est-elle impliquée dans la sécrétion des Tse?

Nterm

H

OFF

OFF

OFF

Cterm

ON

ON

ON

Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V

D

Senseur: GacS

RetS

P

ON

ON

ON

P

Régulateur de réponse: GacC

L’activation de la voie Gac/Rsm augmente la production et la sécrétion des Tse1-3

Synthèse de RsmZ

(ARN non codant)

RsmA

Tse1-3 toujours sécrétées par le H1-T6SS

SST3

Biofilm

(GDR Pseudomonas 2008-2011, Patrick Plesiat )

slide12

Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2

Hyp: locus tse2 tsi2 essentiel pour la viabilité de l’organisme

∆tsi2

Tse2

Tsi2

(-) Vecteur contrôle

Inductible à l’IPTG

(+) Vecteur avec tse2

tse2

tsi2

protéine toxique

Inhibition de la croissance P.aeruginosa

protéine d’immunité

Type VI SecretionImmunityprotein 2

Tse2

Tsi2

Tse2 seul

slide13

Interaction des protéines Tse2 et Tsi2

Interaction des protéines Tse2 et Tsi2

Bactérie (culot)

Lyse (sonication)

ultra

Fraction

membranaire

(culot)

Fraction solubles (SN)

Cytoplasme + périplasme

Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V

tsi2-V tse2-GSK

tsi2 tse2-GSK

tsi2

tse2-GSK

tsi2-V

tse2-GSK

slide14

Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2

Interaction des protéines Tse2 et Tsi2

Coimmunoprécipitaion de Tsi2-V et Tse2-GSK

Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V

tsi2

tse2-GSK

tsi2-V

tse2-GSK

Bille d’agarose couplé à l’Ac anti-VSV-G

Tsi2

tsi2-V tse2-GSK

tsi2 tse2-GSK

Tsi2-V

Tse2-GSK

Autres protéines

Interaction directe entre Tsi2 et Tse2

slide15

Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes?

Cellules eucaryotes : Saccharomyces cerevisiae

DO=0.25

DO=0.13

DO=0.06

DO=0.03

DO=1↔ 4.108cellules.mL-1

DO=0.5

DO=1

L’expression de tse2 diminue dramatiquement le nombre de colonies

Tse2 intracellulaire a un effet délétère sur les cellules eucaryotes (S. cereviae, HeLa.)

Coexpression de tsi2 et de tse2 restaure la viabilité à un niveau similaire au contrôle

slide16

Tse2 agit-elle sur les cellules procaryotes?

Escherichia coli

Burkholderia thailendensis

L’expression de tse2 seulinhibe la croissance bactérienne

La protéine Tsi2 protège la bactérie de Tse2

slide17

P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules eucaryotes via le H1-T6SS?

Mesure de la cytotoxicité de différentes souches P.aeruginosa sur des HeLa

∆retS: Tse2 hypersécrétée

∆retS ∆ClpV1 : Tse2 non sécrétée

PAO1: Tse2 non sécrétée

Haute

cytotoxicité

Basse

cytotoxicité

Pas de cytotoxicité provenant de la protéine Tse2 via le H1-T6SS

Tse2 n’est pas injectée par le H1-T6SS

Tse2 extracellulaire non cytotoxique

slide18

P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules procaryotes via le H1-T6SS?

Expérience de croissance compétitive entre ≠ souches de P.aeruginosa

∆retS: Tse2 hypersécrétée

Milieu solide

Milieu liquide

∆retS

∆clpV1

∆retS

∆tse2

∆retS ∆clpV1

+clpV1

∆retS

∆retS

∆retS

∆retS

Tse2 impacte la croissance

de la souche receveuse

(dénuée de Tsi2)

Tse2 requiert un

H1-T6SS fonctionnel

Nécessité d’un contact cellulaire donneur-receveur

slide19

Conclusions

VgrG1, VgrG4 sont des composants H1-T6SS

Tse1, Tse2 et Tse3 sont des substrats du H1-T6SS

L’activation de la voie Gac/Rsm, qui active la formation de biofilm, augmente la quantité des Tse.

Tsi2, la protéine d’immunité, permet à l’organisme de se protéger de Tse2

Tse2 intracellulaire inhibe la croissance de cellules eucaryotes et procaryotes

H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les cellules eucaryotes

H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les souches de Pseudomonas aeruginosasans établir un contact

Biofilm

slide20

Conclusions et Discussions

H1-T6SS : mode de communication entre P.aeruginosa

H1-T6SS : capacité d’adaptation (fitness) en présence d’autres bactéries.

Vie: C’est une P. aeruginosa

P.aeruginosa

Tse2

Mort: C’était une autre bactérie

(Russell & Mougous, juillet 2011)

Expression et activation du SST6 sont élevées dans les isolats de patients atteint de mucoviscidose (Yahr, 2006)

slide21

Cytoplasme

Tse2

Membrane interne

Cellule bactérienne

receveuse

Tse3

Pepdidoglycane

Tse1

Membrane externe

Hcp

Modèle hypothétique

Membrane externe

Tsi1

Cellule bactérienne

donneuse

Pepdidoglycane

Tsi3

Membrane interne

Tse2

Tsi2

Cytoplasme

Tse3

Tsi2-Tse2

Tse1

VgrG