1 Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова 2 Институт экологического почвоведения, Москва

1. MSU INSTITUTE OF SOIL SCIENCE NIKOLA PUSHKAROV Милановский Е.Ю.1, Васильева Н.А.1, Завгородняя Ю.А.1, Демин В.В.2 ГУМИНОВЫЕ КИСЛОТЫ – “АРОМАТИЧЕСКОЕ ЯДРО С АЛИФАТИЧЕСКОЙ ПЕРЕФЕРИЕЙ” ? 1Факультет почвоведенияМГУ им. М.В. Ломоносова 2Институт экологического почвоведения, Москва

2. Цель • необходимо кардинально изменить общий методологический подход к исследованию состава, свойств и функций гумусовых веществ

3. В настоящее время гумусовые кислоты относят к полидисперсным соединениям переменного состава с общим принципом строения. Констатируется, что “гумусовые кислоты обладают близкими физическими и химическими параметрами, которые не зависят от частичных флуктуаций элементного состава и структурных фрагментов в составе отдельных молекул”. (Орлов, 1990)

4. На основе анализа элементного состава препаратов ГК почв разного генезиса и продуктов их кислотного гидролиза предложено строение структурной ячейки ГК Гидролизуемая часть Негидролизуемая часть Ядро Периферическая часть Al2O3, Fe2O3, CaO, SiO2, P2O5 Минеральные компоненты Комплексы, сорбция Орлов, 1974 Мистерски, Логинов, 1959 Блок-схемы гуминовых кислот содержат «ароматическое ядро» (негидролизуемая часть), и «периферические алифатические цепи»(гидролизуемая часть)

5. Структурные фрагменты гуминовых кислот Данные элементного состава ГК до и после гидролиза объединяют с результатами - 13С ЯМР, - Масс спектрометрии, - УФ, ИК -спектрометрии Rice J.A., MacCarthy P., 1991 в одну молекулу, свойства которой определяются соотношением структурных фрагментов Schulten, Schnitzer, 1995

6. Представление гумусовых кислот посредством структурных формул достоинства описывают основные характеристики ГК : - кислотность; хелатные, окислительно-восстановительные и π-акцепторные свойства; полиэлектролитную природу недостатки • молекулярная структура всех ГК сведена к одной • формулы основаны на субъективном принципе объединения структурных фрагментов, которого придерживаются авторы • интегральные показатели структурных фрагментов, в случае анализа многокомпонентных систем,представляют результат множества наложений, что делает полученные данные некорректными…

7. Результаты хроматографического фракционированиягумусовых кислот (ионообменная, экслюзионная и хроматография гидрофобного взаимодействия) позволяют утверждать, что в растворенном состоянии они представлены смесью физически индивидуальных и химически независимых органических соединений

8. При подкислении щелочного экстракта гумусовые вещества с ММ < 30 тыс. дальтон остаются в растворе. В составе ФК не появляется новых фракций с молекулярной массой меньше, чем у ГВ исходного щелочного экстракта. ФК из щелочного экстракта Гель-фильтрация ГВ в составе щелочногоэкстракта. Сефадекс G-50f,0.05М ТРИС-HCl+1%SDS ММ >30 kDa В составе суммы ГВ изначально присутствуют фракции с ММ > 30 тыс. дальтон, которые осаждаются при низких значениях рН. ГВ в составе щелочного экстракта ГК из щелочного экстракта

9. Хроматография гидрофобного взаимодействия ГВ в составе щелочного экстракта Все гидрофобные и часть гидрофильных компонентов в составе суммы ГВ осаждаются при низких значениях рН, представляя по принятой классификации ГК ГВ в составе щелочного экстракта В составе гуминовых кислот присутствует как минимум шесть компонентов, различающихся способностью вступать в гидрофобные взаимодействия ГК из щелочного экстракта Фульвокислоты представлены исключительно гидрофильными соединениями ФК из щелочного экстракта

10. УФ-спектры и коэффициенты цветности компонентов ГВ чернозема Е4/Е6 3.70 4.11 5.03

11. Ионообменная хроматография ГКчернозема D280 NaCl I+II фракция I+II фракция 1.5 М I+II III ДЭАЭ Trisacryl Стартовыйбуфер: 50 мМтрис-HСL рН 9,0; 0,1 М NaCl Лимитирующий буфер: 50 мМ трис-HCl рН 9,0; 1,6 М NaCl Выделенные методом ионообменной хроматографии молекулярные компоненты ГК существенно различаются между собой по молекулярным массам и структуре

12. II Эксклюзионная хроматография ГКтемно-серой лесной почвы (детектирование при 206, 226, 254, 280, 313, 365 и 405 нм) I III II ТSK G 2000 SW Элюент: 50 мМ трис-HCl 0,5 % ДДС Можно предположить, что низкомолекулярные компоненты ГК представляют органические соединения с алифатической структурой. В составе высокомолекулярных компонентов ГК присутствуют конденсированные соединения.

13. Исходная ГК ГК после диоксанового экстракта 60 kDa Диоксановый экстракт из ГК Лигнин древесины ели Молекулярно-массовое распределение классон-лигнинов, диоксан-лигнинов и гуминовых кислот. Каршкова, Демин, Завгородняя, 2004 10 kDa ГК 60 kDa классон-лигнин диоксан-лигнин В составе ГК присутствуют компоненты, с молекулярными параметрами, аналогичными лигнину

14. Элементный состав гумусовых кислот почв, ат. % 41 Ферраллитная 49 Дерново-подзолистая Чернозем Приведена площадь фракций гидрофильных и гидрофобныхкомпонентов гумусовых кислот (%) ГК 59 59 51 41 93 97 93 ФК

15. Предположение варьирование содержания компонентов в составе гумусовых кислот обусловливает характерные различия диагностических показателей, установленных на основе анализа не фракционированных препаратов

16. Для проверки данного предположения проанализированы 1. Водорастворимое органическое вещество, вымываемое из монолита чернозема 2. ГВ, выделенные щелочным раствором пирофосфата натрия из фракции мелкой пыли (2,0-2,4 г/ см3). чернозема под целинной растительностью с глубины 40-45см).

17. Водорастворимые гумусовые вещества Гумусовые вещества без водорастворимой фракции, в почве 5,66% углерода 6,16 – 5,66 = 0.50 (8,11%) Выделение водорастворимого ОВ из монолита чернозема H2O Гумусовые вещества, контроль в почве 6,16% углерода Водо-растворимые гумусовые вещества

18. Схема выделения и анализа ГВ из грануло-денсиметричесчкой фракции чернозема • Выделение фракции мелкой пыли (седиментация) • Выделение из пыли денсиметрический фракции с плотностью 2,0-2,4 г/ см3 • Экстракция ГВ (NaOH+Na4P2O7), центрифугирования, фильтрация • Гидрофобная хроматография и сбор фракций I-IV • Осаждение ГК (рН 1.5, HCl) из фракций I-IV, центрифугирование • Диализ фракций ГК против воды, сушка 40ºС • Элементный анализ гель-фильтрацияи фракций I - IV IV III I II

19. Элементный состав ВОВ и молекулярных фракций гуминовых кислот % ВОВ C H O I C:H C:O II IV III C:N «Эталон» ГК чернозема Орлов, 1974

20. I II III IV Гель - хроматограммы компонентов ГК I II IV III 5330 72000 2300 69500 1080

21. Гумусовые кислоты обладают близкими физическими и химическими параметрами, которые не зависят от частичных флуктуаций элементного состава ? Ф р а к ц и и Г К

22. Мы знаем, что объект нашего исследования - Локализован во фракции мелкой пыли - Имеет плотность 2,0-2,4 г/см3 - Растворим в щелочном растворе пирофосфата натрия - Содержит как минимум пять органических компонентов, различающихся способностью вступать в гидрофобные взаимодействия и осаждаться при низких значениях рН - Данные компоненты существенно различаются по молекулярной массе элементному составу

23. Что представляют компоненты ГВ - не известно - Новый класс органических веществ из: • индивидуальных химических соединений • комплексов • полимерных образований неопределенной структуры с близкими параметрами химических и физико-химических свойств - Смесь дереватов индивидуальных органических соединений из растительности, микроорганизмов и зоофауны

24. Химия гумусовых кислот повторяя основные этапы развития химии белка: и находится по отношению к вопросам строения гуминовых кислот на уровне XVIII – XIX века конец XVIII века– белки как новый класс органических веществ до середины XIX века – вещества переменного состава (на базе элементного состав смеси белков) конец XIX века– индивидуальные химические соединения

25. «… было бы правильно целиком отбросить всю номенклатуру гуминовых кислот, начиная с гуминов и ульминов и . . . кончая фульвовой… …эти названия обозначают не определенные химические соединения, но просто препараты, полученные особыми способами.» Зельман Абрахам Ваксман 1936 г. Нобелевская премия 1952 г. по физиологии и медицине

27. Хроматограммы ГВ почв В ВА АВ А Ч е р н о з е м ы Т. каштановая Каменная степь, Воронеж Островцовская степь, Пенза Бугурусланский район Стрелецкая степь, Курск Первомайский район Оренбургская обл. Подзолистая Al-Fe- гумусовая Серая лесная с ВГГ Ферраллитная Торфяно-глеевая