实验七丹磺酰化法分析蛋白质 N — 末端氨基酸

实验七丹磺酰化法分析蛋白质 N—末端氨基酸 刘德立 2010. 3

一、实验原理 DNFB法：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。蛋白质N-末端分析的方法主要有二硝基氟苯（DNFB）法、丹磺酰氯（DNS）法、苯异硫氰酸酯（PITC）法和氨肽酶法等。

DNS法：在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以与蛋白质N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氯-氨基酸。DNS法：在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以与蛋白质N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氯-氨基酸。

蛋白质的-氨基与丹磺酰氯反应，生成DNS-蛋白质，经水解生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质N-末端氨基酸。蛋白质的-氨基与丹磺酰氯反应，生成DNS-蛋白质，经水解生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质N-末端氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol，灵敏度比DNFB法高100倍。聚酰胺薄膜展层时，展层剂与被分离物在聚酰胺薄膜表面竞争形成氢键，键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。因此，选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺薄膜表面发生吸咐—解吸咐—再吸咐 —再解吸咐的连续过程，达到分离的目的。

二实验器材及试剂 1 标准氨基酸（甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸，丙氨酸，组氨酸）。 2 未知蛋白质样品。 3 DNS-Cl丙酮溶液：称取丹磺酰氯250mg溶于100ml丙酮溶液中，储存于棕色瓶中，置冰箱中保存，一个月内稳定。 4 6mol/l盐酸，1mol/l盐酸。 5 0.2 mol/l碳酸氢钠溶液。 6 展层液 : 1.5%甲酸（88%甲酸：水=1.5:100 V/V)。 7 乙酸乙酯。 8 烘箱，紫外分析灯，层展用平皿及烧杯等 9 聚酰胺薄膜

称0.5mg 蛋白质样品于有塞玻璃管中 → 少量水溶解 → 加0.5ml 0.2mol/l 碳酸氢钠溶液→0.5ml DNS-Cl 丙酮溶液→ 三乙胺调pH9.0-9.5→塞好塞子，于40℃烘箱中反应2h →生成DNS-蛋白质真空蒸去丙酮→ 加0.5ml 6mol/l盐酸→移入水解管，抽真空封管 →110 ℃ 水解18-24小时→ 蒸去盐酸加0.5ml水→ 用1mol/l盐酸调pH2~3→ 加0.5ml 乙酸乙酯抽提2-3次→蒸去乙酸乙酯→加100ul丙酮溶解三、操作步骤 1. 未知蛋白层析样品的制备—三步法（老师做）蛋白质N-末端氨基酸的DNS化 DNS-蛋白质的水解 DNS-氨基酸的抽提

2. 标准氨基酸层析样品的制备 取0.1ml氨基酸溶液于1.5ml EP管中加入0.1ml DNS-Cl丙酮溶液(三乙胺调pH) 室温（25 ℃）放置2-4小时(或40 ℃ 2h) 加0.3ml 乙酸乙酯,充分振荡，静置5min后抽提,取上清液0.2ml 60 ℃烘箱中蒸去乙酸乙酯加入0.1ml丙酮定容，作为点样样品

3. DNS-氨基酸的层析与检测 取7 ╳ 7cm薄膜一块，距底1 cm 处用铅笔轻画一直线，依次轻画间距为1cm的六个点样点聚酰胺薄膜的准备用毛细管取样，在点样位置上点样2~3次，每点一次，吹干一次，点样直径应小于2mm，做好点样记录点样将膜展成筒形，样品在筒内，箍以橡皮筋固定。向60mm培养皿中倒入展层液10ml左右，将膜垂直放入，外罩一烧杯，进行层析层析紫外观察展层液上升至顶端约0.5cm时，取出，稍干后放入紫外灯（360nm或280nm)下观察

点样模式图 标准氨基酸1 标准氨基酸2 标准氨基酸3 标准氨基酸4 蛋白质样品1 蛋白质样品2 返回

Gly His Lys AlaPhe 未知样品1 Gly His Lys AlaPhe 未知样品2 四、记录实验结果根据展层结果，绘制层析结果图，并标明未知蛋白的N-末端的氨基酸种类预备实验层析图

五、注意事项 • 在聚酰胺薄膜上画基线及点样点时要轻，避免损坏膜上介质。 • 点样直径尽量小，一般不超过2mm，若多次点样，则每次点完吹干后再点，点样要轻而快。 • 展层时要尽量密闭，可在平皿下铺一层卫生纸，保证层析液在展层缸中达到饱和相。

六、思考题 1 薄膜层析与其他层析方法比较有哪些优点？ 2 选用展层剂的依据是什么？

实验七 丹磺酰化法分析蛋白质 N — 末端氨基酸