微生物工程（二）

1. 微生物工程（二）

2. 四 微生物的营养和生长 1 微生物的主要组成

3. 2 微生物培养营养物质 1）碳源: 无机碳源：二氧化碳或碳酸根离子 有机碳源：葡萄糖等 2）氮源 无机碳源：氨、铵离子元素 有机碳源：富含蛋白质的物质 3）无机盐 4）能量： 来自光能 来自化学反应，ATP 6）微量元素 7）生产因子、抗生素、维生素等。

4. 五、发酵工业的生产流程 发酵工业的生产过程： • 原料预处理 • 培养基配置 • 发酵设备和培养基的灭菌 • 无菌空气的制备 • 菌种的制备和扩大培养 • 发酵（微生物培养） • 发酵产品的分离和纯化

5. （一）原料预处理 1：原料 玉米、薯干、谷物 2：处理方式 原料粉碎 淀粉或其他高分子物质的降解：酸催化、酶催化等

6. （二）发酵培养基的配置和灭菌 1 微生物的营养来源

7. 2 培养基的类型 1）依据培养基的营养成分划分 天然培养基 合成培养基 综合培养基 2）根据培养基原物质状态划分 液体培养基 固体培养基

8. 3）根据培养基用途划分 基础培养基：满足一般微生物野生型菌株最低营养要求 鉴别培养基：加入指示剂，可分出不同微生物类型 增殖培养基：加入额外物质，用于促进某类而抑制其他类 选择培养基：加入杀菌作用物质，挑出抗菌的菌类 活体培养基：活的动植物体或离体的生活细胞 4）根据生产目的划分 种子培养基：用于种子培养 发酵培养基

9. 3 发酵培养基的选择 （1）必须提供合成微生物细胞和发酵的基本成分 （2）有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物的数量或最大产率 （3）有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位体积发酵罐的生产能力 （4）有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期 （5）尽量减少副产品的合成速度，缩短发酵周期 （6）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，通过提高氧的利用率，降低成本能耗。 （7）有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”物质。

10. 4 培养基灭菌 消灭杂菌和噬菌体 高压水蒸气直接对培养基进行加热 121℃ 20～30min 但是对于温度敏感的营养物质及在高温下能发生反应的物质，应采取其他灭菌方法或单独灭菌后再混合的方法。

11. （三）无菌空气的制备 空气除菌：针对好氧发酵 空气除菌过程 • 高空采风 • 空气压缩机加压 • 灭菌（加热或过滤）

12. （四）、微生物种子制备 1 种子的标准 质：生命力旺盛、无杂菌的纯种培养物 量：接种体积须达到发酵罐体积的1～5％，有的可能更高。 种子罐：用于培养种子的发酵罐 2 种子的扩大培养 目的：在为微生物细胞提供适宜的特定的微生物生长的物理和化学环境中，大量繁殖，为生产提供相当数量的代谢旺盛的种子。 好处： • 接种量大，缩短发酵周期 • 提高发酵罐利用率 • 减少杂菌污染的机会

14. （五）发酵过程的操作方式 1 间歇发酵，又叫分批发酵，最简单也是最常见的工业发酵方式。 它是在一个密闭系统内一次性加入营养物质和菌种进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。但中间须对pH和温度进行控制。 优点：操作简单、不容易染菌、投资低 缺点：生产能力和效率低，劳动强度大，而且每批发酵的结果都不完全一样，对分离提纯造成了困难。

15. 间歇发酵的中微生物生长过程 （1）迟滞期 （2）对数期 （3）稳定期 （4）衰亡期 注意：微生物的初级代谢物往往是与其生长相平行。 次级代谢通常是微生物的对数生长期末期或稳定期产生的。

16. 2 连续发酵 理论基础：在分批发酵中，随着微生物的活跃生长，营养物质不断损耗，有害的代谢产物不断积累，对数生长期不可能长期维持。因此，若将营养物浓度和培养条件维持在对数生长期不变，则对数生长可以无限延长。这样连续发酵可以保证细胞高速增长或产物高速形成。 定义：在向发酵罐连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液以相同的速度连续放出。 特点：连续发酵可使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效的延长分批培养中的对数期。在恒定的状态下，微生物所处的环境条件如营养浓度、产物浓度、pH、微生物细胞的浓度以及生长速率等可以始终维持不变，甚至可以根据需要来调节生长速度。

17. 使用范围：废水处理，葡萄糖发酵、酒精发酵 优点： • 提高设备利用率 • 提高原料利用率 • 便于实现自动控制 缺点 • 容易引起杂菌污染 • 对设备、仪器要求高。

18. 3 流加发酵 流加发酵，又叫补料分批发酵，或半连续发酵。是介于连续发酵和分批发酵之间的一种方法。 它是指在分批培养的过程中，间歇地或连续地补加新鲜培养基，但所需产物不到一定时刻不放出来的培养方法。 特点：在流加阶段按一定的规律，向发酵罐中连续地补加营养物质或前体，由于发酵罐不向外排放产物，罐中的发酵液体积不断增加，直到规定体积后放罐。

19. 举例1 面包酵母的生产

20. 举例2：抗生素发酵

21. （六）发酵产品及其分离提纯工艺 1 发酵产品 根据代谢水平分： • 初级代谢产物（能量代谢）：醇、有机酸、氨基酸等 • 次级代谢产物：抗生素等 根据是否分泌到细胞外 • 胞内产品 • 胞外产品

22. 2 分离提纯

23. 六、生物反应器 （一）细胞生物反应器——发酵罐 1 厌氧发酵罐 2 好氧发酵罐

24. （二）发酵过程的检测和控制 过程参数的测量和操作变量的调节 过程的模型化与控制策略

25. 七、微生物产品 微生物发酵的本质是某种微生物将一种物质(底物) 转化成为另一种物质(产物) 的过程, 这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应, 简言之, 即为一种利用微生物酶或微生物本身的合成技术。 酶催化与微生物发酵区别在于: 前者是一个单一的酶催化的化学反应, 而后者为了实现这一酶催化反应，需要为微生物提供一个能够生物合成这些酶的条件。 另外, 尽管用于生物转化的酶大多来自于微生物, 但也可以是来自于动物和植物的酶。 而对于一个具体的生物转化来说, 究竟是采用微生物发酵技术,还是采用酶催化技术, 这要综合考虑实现这一过程的诸多因素, 如成本、环境、技术装备和质量要求等。

26. （一）氨基酸的生产工艺 目前，应用发酵法生产氨基酸的种类有22种，其中，谷氨酸是产量最大、最典型、最成熟的一种。本次就以谷氨酸为例介绍氨基酸发酵工艺。

27. 1 合成机理 以葡萄糖为碳源，经过EMPH途径和TCA途径循环合成谷氨酸。

28. EMP途径

29. 1.丙酮酸脱氢酶复合体 10.苹果酸脱氢酶 2.柠檬酸合成酶 3.顺乌头酸酶 9.延胡索酸酶 4.顺乌头酸酶 5.异柠檬酸脱氢酶 8.琥珀酸脱氢酶 7.琥珀酰CO A 6.-酮戊二酸脱氢酶 TCA 循环

31. 2 菌种的选育 ——野生正常菌种的氨基酸生产刚好满足自身需要 ——可以通过以下改造途径，使菌种的氨基酸产量大幅度提高。 ①代谢调节控制； ②细胞膜通透性的特异调节； ③发酵条件的适合； ——几乎所有的生产氨基酸菌种都是谷氨酸杆菌或黄色短杆菌经过。谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸

32. 3 工艺过程 • 淀粉水解糖的抽取 • 谷氨酸生产菌种子的扩大培养 • 谷氨酸发酵 • 谷氨酸的提取分离 • 谷氨酸制味精

33. 1） 淀粉水解糖的制取 • 酸水解法 • 双酶法：淀粉酶和糖化酶 • 酶酸法：先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖 • 酸酶法：先用α-淀粉酶液化到一定程度，再用酸水解成葡萄糖。

34. 2）发酵过程： 谷氨酸产菌经活化，经种子扩大培养，接入发酵罐，在温度32～38℃，pH7.0左右的条件下，好氧发酵30h左右，可制得。 3） 过程控制 （1）生物素 只有当生物素限量的情况下，脂肪酸合成才不完全，导致细胞发生变形，谷氨酸从胞内渗出，积累于发酵罐中。因此应该控制生物素的含量。

35. （2）种龄和种量的控制。 一级种子：11～12h 二级种子：7～8h 接种量；1％ （3）温度：发酵过程会产生大量的热，必须控制温度。一般采用二段温度控制法：前0～12h 32～34℃， 而在16h后34～36℃ （4）融解氧：长菌阶段低风量，产酸阶段高风量，发酵成熟期又转为低风量 （5）pH值。在发酵过程中，pH是变动的，必须根据微生物生长和发酵目的调控pH值。通过流加尿素来及时调整pH值，并补充N源。 （6）中间补料。 （7）防止噬菌体和杂菌污染。谷氨酸发酵一般是生物素缺陷型，一般对噬菌体和杂菌抵抗能力弱。

36. 4 谷氨酸提取 根据谷氨酸的两性电离等性质进行分离和提纯，一般包括等电点法、离子交换法等 5 谷氨酸制味精 中和——中和液除铁和除锌——中和液脱色——中和液的浓缩和结晶。

37. （二）维生素 1 关于维生素 维生素是一类有机化合物，在天然食物中含量极少；这些极微小的量对人体的生长和健康是必须的，人体不能合成它们，必须从食物中摄取，人体若缺乏维生素，会出现维生素缺乏症。 脂溶性V：A、D、E、K 水溶性V：C、B1、B2、B6、B12

38. 2 维生素发酵生产——以维生素C为例 维生素 C又称L-抗坏血酸，分子中C2及C3位上的两个相邻的烯醇式羟基极易分解释放H+，因而成酸性，又因其为烯醇式结构，C2及C3位羟基上2个氢原子可以全部脱去而生成脱氢抗坏血酸，后者在有供氢体存在时，又能接受2个氢原子再转变为抗坏血酸。 人体对维生素C的需要全部由外界供给。维生素C主要生物学功能包括 （1）参与体内的羟化反应。 （2）具有还原作用。 （3）对金属离子的络合作用，防止中毒。 （4）促进抗体形成，增强免疫功能。 （5）抗感染作用等.

39. 发酵生产——“莱氏法”

40. 发酵生产——二步三级发酵 （1）D-山梨醇经醋杆菌发酵为L-山梨糖 （2） L-山梨醇经假单胞菌（或氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌等伴生菌混合发酵完成）转化为2-酮基-L-古龙酸 （3）2-酮基-L-古龙酸转化为维生素C

41. 作业 1 、放线菌与细菌、霉菌结构上有哪些区别，查找文献，请列出它们的主要工业产品？ 2、发酵有哪些操作方式？它们各有什么优缺点？