Regulación de metabolismo de carbono en bacterias Gram negativas.

1. Regulación de metabolismo de carbono en bacterias Gram negativas. Caso: Escherichia coli.

2. Los microorganismos • Versatilidad metabólica • Utilizan muchas fuertes diferentes de carbono • Se adaptan continuamente a los cambios del medio • Compiten con otros por nutrientes limitantes

3. Bacteria • Tiene sensores que monitorean su alrededor • Pueden encender y apagar la utilización de un gran número de fuentes de carbono. • Sienten gradientes de concentración de nutrientes. • Se adaptan a cambos de fuerza osmótica, estrés, nutrientes, oxígeno (o falta de) y limitación de nutrientes.

4. Sistema PEP-PTS • Sistema involucrado en: • el transporte y la fosforilación de un gran número de carbohidratos, • movimiento hacia estas fuentes de carbono (quimiotáxis) y • regulación de muchas rutas metabólicas

5. Componentes del sistema Fosfoenolpiruvato (in) + Carbohidrato (out) Piruvato (in) + Carbohidrato-P (in)

6. Sistema fosfotransferasa (PTS). • Energía libre de hidrólis (DG°’) del gupo fosfato del PEP es -14.7 kcal/mol (-61.5 kJ/mol) • La de un grupo fosfato de un carbohidrato tipico es de -3 kcal/mol (-12.5 kJ/mol). • Desperdicio?????

7. Funciones del PTS • Translocación y • fosforilación de sustratos

8. Energética de la PTS • PEP es equivalente al ATP como moneda energética en la célula • Una molécula de ATP se forma a partir de una de PEP durante la glucólisis por la piruvato cinasa. • Por carbohidratos que se acumulan por un sistema no-PTS se gastan más de un equivalente de ATP por unidad de monosacárido. • Uno para el transporte y otro para la fosforilación por ATP

9. Reacciones del sistema PTS

10. Proteínas del sistema PTS • La enzima I (EI) y HPr son proteínas solubles y citoplásmicas • Participan en la fosforilación de los carbohidratos transportados por PTS (proteínas generales del PTS). • Las enzimas II (Ells) son específicas para cada carbohidrato y pueden ser: • Una proteína sencilla unida a la membrana que tiene 3 dominios (A, B, y C), como para el manitol. • Dos o más proteínas en la que al menos una es membranal (e.g., B y C) y una es soluble (IIA o enzima III [EIII]) como la IICBGlc_IIAGlc para glucosa en E. coli

12. Proteína Hpr • Hpr por Histidine protein (proteína de histidina) • Proteína pequeña monomérica de 9,000 a 10,000 Da excepto cuando hace un dominio con la fosofotransferasa específica del carbohidrato como FPr de S. typhimurium. • Se fosforila en una histidina conservada por la P-EI (residuo de histidina 15 en E. coli).

13. La fosforila P-EI en la posición N-1 de un residuo de histidina (His-15 en E. coli HPr), • Todas las HPrs secuenciadas o de aquellas que se ha deducido la secuencia tienen este residuo y su entorno altamente conservado.

15. <

16. <

22. Organización del operón PTS CRP : factor positivo de transcripción

24. œ

25. Fuente de carbono represora Lactosa maltosa Regulación del carbono por catabolito en bacterias entéricas Gram negativas. Exclusión del inductor El modelo muestra a una célula bajo dos condiciones: 1, en presencia de una fuente de carbón represiva (fondo blanco), y 2, en ausencia de la fuente represiva de carbón (fondo gris). ATP CCW GK IIAGlc P + IIAGlc Cya GP FM cAMP + CheY/A P + CAP HPr BglG BglG, proteína antitermidadora del operón -glucósido CAP, proteína activadora por catabolito CCW, rotar en contra de las manecillas del reloj CheY/A, proteínas de quimiotaxis Cya, adenilato ciclasa EI, enzima fosfotransferasa I del sistema PTS FM, motor del flagelo GK, glicerol cinasa GP, glicógeno fosforilasa Hpr, fosfotransferasa del PTS con histidina + EI P PEP CCR global Piruvato

26. Regulación por catabolito en bacterias Gram positivas con bajo contenido de GC El esquema muestra una bacteria bajo dos condiciones: 1, en presencia de una fuente de carbono represora (fondo blanco), y 2, en ausencia de la misma fuente (fondo gris). Fosforilación flechas sólidas Fuente de carbono represora galactosa maltosa SacT Exclusión del inductor + Hpr P-his- CW (vuelta) GK FBP HPr Hpr -ser-P FM HPrK/P CcpA CheY/A ATP -/+ ADP EI P CcpA, proteína de control por catabolito CheY/A, proteína de quimiotéxis cre, elemento que responde al catabolito CW, a favor de las manecillas del reloj EI, enzima I del sistema PTS FM, motor del flajelo FBP, fructose-1,6-bifosfato GK, glicerol cinasa HPr, fosfotransferasa del sistema PTS que contiene histidina HPrK/P, HPr cinasa/fosfatasa SacT, proteína antiterminadora del operon de sacarosa cre PEP CCR/CCA global Piruvato

30. Domain structure of the transcription antiterminator LicT and the transcription activators LicR and LevR of B. Subtilis.

34. Cra y reg carbono JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 1996, p. 3411–3417 Vol. 178, No. 12

35. cAMP-independent mechanisms of catabolite repression were operative in E. coli (7, 15). • the mechanisms of catabolite repression in evolutionarily divergent bacteria are not the same (17, 37, 38).

36. The catabolite repressor/activator (Cra) protein of enteric bacteria was initially characterized as the fructose repressor, FruR. • Mutants defective in the cra gene (previously designated fruR) exhibited a pleiotropic phenotype, being unable to grow with gluconeogenic substrates as the sole carbon source (5, 13).

37. the cra gene controlled the transcriptional expression of numerous genes concerned with carbon and energy metabolism (4, 12, 14, 39).

38. Cra protein, a member of the LacI-GalR family, recognizes an imperfect palindromic DNA sequence to which it binds asymmetrically.

39. 2 modos de acción de Cra • If this Cra operator precedes the RNA polymerase binding site, it activates transcription of the downstream operon, but if it overlaps or follows the RNA polymerase binding site, it represses transcription.

40. The effects of Cra on transcription are counteracted by micromolar concentrations of fructose-1-phosphate and millimolar concentrations of fructose-1,6-bisphosphate, which promote catabolite repression of Cra-activated operons and catabolite activation of Cra-repressed operons.

41. Cra apparently controls the direction of carbon flow in E. coli and consequently influences the rates of utilization of dozens of exogenous carbon sources.

42. CENTRAL IMPORTANCE OF THE FRUCTOSE-SPECIFICPHOSPHOTRANSFERASE SYSTEM (PTS) • Fructose has important in the early evolution of carbohydrate metabolic pathways in bacteria. • Fructose is the only sugar that feeds directly into the centrally important Embden- Meyerhof glycolytic pathway without isomerization or epimerization. • The metabolism of fructose can be initiated by two distinct routes, and in E. coli both routes are mediated by the phosphotransferase system (PTS) (Fig. 1).

43. The sequence of phosphoryl transfer events in the PTS-catalyzed phosphorylation of fructose in E. coli. PEP,

44. CENTRAL IMPORTANCE OF THE FRUCTOSE-SPECIFICPHOSPHOTRANSFERASE SYSTEM (PTS) • The fructose PTS of E. coli is unique in possessing its own HPr-like protein domain, FPr, encoded within the fructose (fru) catabolic operon. • Bacteria in many evolutionarily divergent genera (e.g., Azospirillum, Fusobacterium, Lactobacillus, Listeria, Pseudomonas, Rhodobacter, Streptomyces, etc.) possess the high-affinity fructose-specific PTS, but they apparently cannot phosphorylate other sugars via the PTS (16, 22, 23, 32, 33, 42, 44).

45. in Haemophilus influenzae, the first bacterium for which a completely sequenced genome became available (10), genes only for a fructose-specific PTS permease are found. • In E. coli three silent gene clusters (designated frv, frw, and frx) uniquely encode silent “backup” fructose PTSs of unknown physiological function (31).

46. Finally, the fru operon of enteric bacteria is regulated at the transcriptional level primarily by Cra, although the cAMP-CRP complex plays a secondary role (9).

47. ISOLATION AND PROPERTIES OF cra MUTANTS • First isolated by selecting for strains that synthesized the protein products of the fructose (fru) catabolic operon at high constitutive levels. • ptsH mutants of E. coli and Salmonella typhimurium lack the small phosphocarrier protein of the PTS, HPr, and consequently cannot utilize most PTS sugars (glucose, mannitol, N-acetyl glucosamine, etc.).

48. Función de Csr (carbon storage regulator) • Esto se lleva al cabo usando una proteína pequeña que se une a RNA, CsrA, que reconoce y se une específicamente a mRNAs, en vez de a secuencias específicas de DNA.